鲍芸;肖艳;蒋玲丽;王雪亮;杨依绡;王华梁
【摘 要】Objective To evaluate the performance of hereditary deafness genetic testing in external quality assessment (EQA) program of Shanghai. Methods In 2017 EQA program, 9 loci on 4 different genes were investigated. The sample panel consisted of 5 different dry blood spots. Participating laboratories were asked to report the results before deadlines. The scores of laboratories were calculated, and the overall consistency rates of different loci as well as different methods and reagents were calculated, and error sorting was evaluated. Results Totally, 18 valid laboratory results were received, and 77.78％ laboratories submitted correct results for all samples, 5.56％ laboratories reported with errors but were overall qualified, and 16.67％ laboratories reported with errors and were overall unqualified. The consistency rate was 100％ for negative samples (wild type samples) and93.59％ for positive samples (mutant samples). There were 10 error results, all of which were false negative.Conclusions The overall accuracy rate of clinical laboratorie
韩国抒情歌曲s enrolled in the program of Shanghai is high. Quality controls in clinical laboratories is essential to assure the accuracy of results.%目的 通过开展遗传性耳聋基因检测室间质量评价(EQA),评估上海地区临床实验室遗传性耳聋基因检测能力,以提高检测质量.方法 2017年EQA共涉及4个耳聋相关基因的9个突变位点,样本盘包含5个样本,样本类型为干血斑.要求参评实验室收到样本后在规定时间内检测并上报检测结果.计算各实验室成绩、不同样本的总体符合率及不同检测方法的符合率,统计检测错误类型.结果 共收到18份有效回报结果.77.78％的实验室回报结果完全正确,5.56％的实验室出现错误结果但总成绩合格,16.67％的实验室成绩不合格.阴性样本(野生型样本)的检测符合率为100％,阳性样本(突变型样本)的检测符合率为93.59％.共出现检测错误10个,错误类型集中表现为假阴性.结论 上海地区临床实验室遗传性耳聋基因检测总体准确率较高,质量控制对于保证检测结果的准确性具有十分重要的作用.
【期刊名称】《检验医学》
【年(卷),期】2019(034)003
【总页数】4页(P267-270)
【关键词】遗传性耳聋;基因检测;室间质量评价
【作 者】鲍芸;肖艳;蒋玲丽;王雪亮;杨依绡;王华梁
【作者单位】上海市临床检验中心, 上海 200126;上海市临床检验中心, 上海 200126;上海市临床检验中心, 上海 200126;上海市临床检验中心, 上海 200126;上海市临床检验中心, 上海 200126;上海市临床检验中心, 上海 200126
【正文语种】中 文
【中图分类】R446.1等不来
先天性耳聋是人类最常见的出生缺陷之一，发病率约为1‰～3‰，其中50%以上由遗传因素导致[1-2]。与耳聋相关的基因很多，但大部分耳聋是由少数几个基因的突变导致的。目前，我国临床上已经明确的先天性耳聋基因包括GJB2、GJB3、SLC26A4等，而线粒体DNA突变是中国人药物性耳聋的主要诱因[2-5]。2007年，王秋菊等[6]首次在我国提出了新生儿耳聋基因筛查的实施方案，随后耳聋基因检测逐步在临床上开展。耳聋基因检测能够从分子水平明确耳聋的致病原因，为早期临床干预、指导安全用药及遗传咨询等提供依
据，逐渐成为新生儿筛查常规项目。
目前，临床上用于耳聋基因突变检测的方法有荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）、基因芯片杂交法、Sanger测序法、二代测序法等[5-7]。中国食品药品监督管理总局认证的检测试剂盒主要采用荧光PCR，突变阻滞扩增系统-PCR、PCR+导流杂交法及PCR+芯片杂交法。这几种方法在检测过程中均涉及体外特异性PCR扩增，容易导致结果出现假阳性或假阴性。不同检测试剂所涉及的基因位点不尽相同，但主要为4个耳聋相关基因的9个突变位点，包括GJB2 [35delG（rs80338939）、76del16（rs750188782）、235delC （rs80338943）、299delAT （rs111033204）]、 GJB3[538C＞T（r s 7 4 3 1 5 3 1 9）]、线粒体1 2 S r R N A[1494C＞T（rs267606619）、1555A＞G（rs267606617）]、SLC26A4[IVS7-2A＞G（rs111033313）、2168A＞G （rs121908362）]。本研究针对以上位点开展了2017年室间质量评价（external quality assessment，EQA），通过分析实验室上报结果，发现临床实验室在耳聋基因检测中存在的问题，以提高耳聋基因检测质量。
1 材料和方法
1.1 EQA样本的制备黄致列 那个人
将以正常人全血为基质、加入一定比例的相关耳聋基因突变细胞系样本制备成的全血滴在滤纸片上，制成直径为1.6 cm的滤纸干血斑。
1.2 EQA样本的评价
采用飞行时间质谱、二代测序法和Sanger测序法对样本进行检测以确定靶值。飞行时间质谱使用20项遗传性耳聋基因突变检测试剂盒（广州达瑞生物公司），采用激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）系统进行突变检测。二代测序法使用遗传性疾病相关HBA2/HBB/SLC26A4/GJB2/GJB3/ATP7B/PAH基因突变检测试剂盒（广州达瑞生物公司）进行文库构建，采用DA8600基因测序仪（广州达安基因公司）进行突变检测。Sanger测序法使用血液基因组 DNA快速抽提试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]分离得到基因组DNA，以Pfu DNA Polymerase 高温聚合酶[生工生物工程（上海）股份有限公司]进行PCR后，采用3730xl DNA 测序仪（美国ABI公司）进行突变检测。
1.3 EQA方案设计
遗传性耳聋基因检测项目EQA为每年1次，EQA样本盘含有5个样本。将样本统一编码后通过冷链快递至各参评实验室。考虑到不同临床实验室的实际情况，允许选择实验室开展的检测位点回报结果。要求参评实验室采用日常检测系统（仪器、试剂、方法）进行检测，并在规定时间内（自样本接收后3周之内）将检测结果上报至上海市临床检验中心数据库，超过规定时间系统拒收数据。
1.4 回报结果评价标准与分析三级片女星
依据回报结果计算各参评实验室的得分情况。具体评价标准:（1）突变型样本报告为“突变型”为可接受结果，报告为“野生型”成绩为“0”分；（2）野生型样本报告为“野生型”为可接受结果，报告为“突变型”为不可接受结果，在总成绩中扣除相应分数；（3）单个位点检测成绩=（测定可接受结果数/所有上报结果数）×100；（4）总成绩=每个位点检测成绩之和/检测位点个数，得分≥80分判定为EQA成绩合格，＜80分为不合格，未回报结果的位点不参与计分。同时对错误的检测结果进行统计，计算不同突变位点及不同检测方法的符合率。
2 结果
2.1 EQA样本验证结果
2017年遗传性耳聋基因检测EQA样本盘构成及各位点检测符合率见表1。
2.2 遗传性耳聋基因检测实验室总体回报情况
2017年遗传性耳聋基因检测EQA参评实验室为24家，收到的有效回报结果18份。有15家实验室上报了全部9个位点的检测结果，有3家实验室不检测GJB2 35delG（rs80338939）和GJB3 538C＞T （rs74315319）位点，仅上报7个位点的检测结果。
24家参评实验室中，Sanger测序法和PCR+导流杂交法是最常用的检测方法，使用率分别为33.33%（6/18）和27.78%（5/18），其次为PCR+芯片杂交法和实时荧光PCR，使用率均为16.67%（3/18），仅1家实验室使用飞行时间质谱，使用率为5.56%（1/18）。
表1 2017年遗传性耳聋基因检测EQA样本盘构成及各位点检测符合率（%） 靶值 符合率（%）GJB2 35delG（rs80338939）检测位点1721 1722 1723 1724 1725靶值 符合率（%） 靶值 符合率（%） 靶值 符合率（%） 靶值 符合率杂合突变型93.33 野生型 100.00 野生型 100.00 野生型 100.00 野生型 100.00 GJB2 176del16（rs750188782）杂合突变型88.89 野生型 100.00 野生型 100.00 野生型 100.00 野生型 100.00 GJB2 235delC（rs803
38943）杂合突变型83.33 野生型 100.00 野生型 100.00 野生型 100.00 野生型 100.00 GJB2 299delAT（rs111033204）杂合突变型88.89 野生型 100.00 野生型 100.00 野生型 100.00 野生型 100.00 GJB3 538C＞T（rs74315319）野生型 100.00 野生型 100.00 野生型 100.00 野生型 100.00 杂合突变型100.00线粒体12SrRNA1494 C＞T（rs267606619）野生型 100.00 野生型 100.00 野生型 100.00 异质突变型94.44 野生型 100.00线粒体12SrRNA1555A＞G（rs267606617）野生型 100.00 野生型 100.00 野生型 100.00 异质突变型94.44 野生型 100.00 SLC26A4 2168A＞G（rs121908362）野生型 100.00 野生型 100.00 野生型 100.00 野生型 100.00 野生型 100.00 SLC26A4 IVS7-2A＞G（rs111033313）野生型 100.00 野生型 100.00 野生型/杂合突变型100.00 野生型 100.00 野生型 100.00
2.3 各实验室检测能力评价
2017年遗传性耳聋基因检测EQA中，77.78%（14/18）的实验室回报结果完全正确，5.56%（1/18）的实验室出现错误结果，但总成绩合格，16.67%（3/18）的实验室检测成绩不合格。在使用不同检测方法的实验室中，采用实时荧光PCR、PCR+导流杂交法和PC
R+芯片杂交法进行检测的参评实验室得分全部为100分；采用Sanger测序法的实验室50%（3/6）总成绩为100分，50%（3/6）总成绩＜80分；1家实验室采用飞行时间质谱，得分为89分，总成绩合格。
阴性样本（野生型样本）的检测符合率为100%（624/624），阳性样本（突变型样本）的检测符合率为93.59%（146/156）。共出现检测错误10例，错误类型集中表现为假阴性，9例错误结果出现在使用Sanger测序法检测的实验室中，1例出现在使用飞行时间质谱法检测的实验室中。
3 讨论兰陵王插曲有哪些
遗传性耳聋基因检测能够从分子水平明确耳聋的致病原因，为早期临床干预、指导安全用药及遗传咨询等提供依据，逐渐成为新生儿筛查常规项目。本研究对上海地区临床实验室耳聋基因检测能力进行评价。83.33%（15/18）的实验室EQA总成绩合格，16.67%（3/18）的实验室EQA总成绩不合格，表明各实验室检测水平整体较好，个别实验室检测能力有待提高，这与国内其他的EQA结果一致[8]。
本次EQA采用干血斑样本，对评价实验室的检测能力有明显优势。首先，相对于基因组DNA和质粒DNA等其他类型的样本，干血斑更接近临床样本类型，并参与核酸提取过程，能够很好地监测临床实验室检测全过程，更真实地反映实验室检测质量。其次，相比液体血液样本，干血斑采血量少，便于收集、储存、运输和处理。再次，已有的研究表明从保存1 d到1年的干血斑中提取DNA经PCR扩增，其产物基本等量 [9]，证实干血斑中的DNA具有良好的稳定性。
米娜 电话情缘2017年EQA共出现10个错误结果，其中9个出现在使用Sanger测序法检测的实验室中，1个出现在使用飞行时间质谱检测的实验室中。Sanger测序法虽然被认为是基因分型检测的金标准[10]，但目前国内尚无相应中国食品药品监督管理总局注册检测试剂。出现错误结果的实验室使用的均为实验室自配试剂，说明实验室自配试剂的检测性能参差不齐，这也与其他EQA结果一致[11-12]。建议实验室采用自配试剂进行检测之前应对其检测性能进行评估。
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