和含药血清中3种活性成分含量
宋祯彦1，何攀2，李富周1，贺春香1，余婧萍1，成绍武1
1.中西医结合心脑疾病防治湖南省重点实验室，湖南中医药大学，湖南长沙 410208；
2.中南粮油食品科学研究院有限公司，湖南粮食集团有限责任公司，湖南长沙 410005
摘要：目的 建立测定当归芍药散提取物和含药血清中3种活性成分含量的高效液相谱串联质谱方法。
方法 药物提取物样品经甲醇-水（1∶1，V/V）溶液溶解、离心、净化后过0.45 μm滤膜，血清样品适当稀释、过膜后用高效液相谱串联质谱法测定。谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm），茯苓酸流动相为乙腈-0.5 mmol/L乙酸铵水溶液（9∶1，V/V），阿魏酸和芍药苷以乙腈-5 mmol/L乙酸铵水溶液为流动相梯度洗脱，流速0.4 mL/min，柱温35 ℃，进样量5 μL，采用电喷雾离子源，负离子模式，干燥气温度350 ℃，干燥气流速12 L/min，检测方式为多反应监测。结果 当归芍药散中阿魏酸、芍药苷和茯苓酸分别在0.1～20.0 μg/mL、1～100 μg/mL、0.1～20.0 μg/mL范围内线性关系良好，加样回收率高，重复性好。
当归芍药散提取物中阿魏酸、芍药苷和茯苓酸含量分别为（127.6±14.9）μg/g、（6081.8±468.0）μg/g和（14.7±0.75）μg/g，当归芍药散含药血清中阿魏酸和芍药苷含量分别为（0.026±0.004）μg/g和（0.61±0.07）μg/g。
结论 本研究建立的方法样品处理简单，方法特异性强，精确度高，重复性偏差小，回收率高，可用于当归芍药散提取物和含药血清中活性成分的质量控制。
关键词：高效液相谱串联质谱法；阿魏酸；芍药苷；茯苓酸；当归芍药散；含药血清
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2021)01-0092-08
DOI：10.19879/jki.1005-5304.202005099 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Content Determination of Three Active Components in Danggui Shaoyao Powder Extracts
and Its Drug-containing Serum by HPLC-MS/MS
SONG Zhenyan1, HE Pan2, LI Fuzhou1, HE Chunxiang1, YU Jingping1, CHENG Shaowu1
1. Key Laboratory of Hunan Province for Integrated Traditional Chinese and Western Medicine on Prevention and
Treatment of Cardio-cerebral Diseases, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China;
2. Research Institute of Zhongnan Grain and Oil Foods, Hunan Grain Group Co., Ltd, Changsha 410005, China
Abstract:Objective To establish a method for the determination of three active components in Danggui Shaoyao Powder extracts and its drug-containing serum by HPLC-MS/MS. Methods The extract samples were dissolved in methanol-water (1:1, V/V) solution, centrifuged and purified, and then passed through a 0.45 μm filter membrane. Serum samples were appropriately diluted, passed through the membrane and determined by HPLC-MS/MS. The column was Agilent Poroshell 120 EC-C18 (100 mm × 2.1 mm, 2.7 μm). The mobile phase of porcine acid was acetonitrile- 0.5 mmol/L ammonium acetate aqueous solution (9:1, V/V), and the mobile phase of ferulic acid and paeoniflorin was acetonitrile- 5 mmol/L ammonium acetate aqueous solution (gradient elution). The flow rate was 0.4 mL/min; the column temperature was 35 ℃; the injection volume was 5 μL. Electrospray ion source and negative ion mode were used; drying gas temperature was 350 ℃; drying gas flow rate was 12 L/min; detection method was multiple reaction monitoring. Results The linear relationship of ferulic acid, paeoniflorin and
基金项目：国家自然科学基金（81774129、82004184）；湖南省自然科学基金面上项目（2018JJ2296）；湖南省自然科学基金青年基金（2019JJ50441）；湖南省高校创新平台开放基金项目（19K065）；湖南省教育厅科学研究项目（18B246）；湖南创新型省份建设专项（2019RS1064）
通讯作者：成绍武，E-mail：****************
pachymic acid in Danggui Shaoyao Powder was good in the range of 0.1–20.0 μg/mL, 1–100 μg/mL, and 0.1– 20.0 μg/mL, respectively. The standard recovery was high and the repeatability was good. The contents of ferulic acid, paeoniflorin and pachymic acid in Danggui Shaoyao Powder extracts were (127.6±14.9)μg/g, (6081.8±468.0)μg/g, and (14.7±0.75)μg/g, respectively. The contents of ferulic acid and paeoniflorin in Danggui Shaoyao Powder- containing serum were (0.026±0.004) μg/g and (0.61±0.07) μg/g, respectively. Conclusion The method established in this study is simple in sample processing, strong in method specificity, high in accuracy, small in repeatability deviation, and high in recovery rate, and can be used for the quality control of the active components in the Danggui Shaoyao Powder extracts and drug-containing serum.
Keywords: HPLC-MS/MS; ferulic acid; paeoniflorin; pachymic acid; Danggui Shaoyao Powder; drug-containing serum
当归芍药散出自《金匮要略》，全方由当归、芍药、川芎、茯苓、白术和泽泻6味药组成，具有滋补肝肾、活血化瘀、化痰通络功效。目前已对当归芍药散进行了大量临床和实验研究[1-2]，该方可用于痛经与慢性盆腔炎[3-4]、慢性肾小球肾炎[5]、黄褐斑[6]等。此外，近年研究表明，当归芍药散可以改善认知功能障碍和记忆损伤[7-8]，是神经退行性疾病的潜在方剂，具有广阔的临床应用前景。
当归芍药散重用芍药补养肝血为君药，配以当归养血柔肝，川芎辛窜舒达、活血通络，三药共以疏理肝脾，是方中主药；茯苓、白术燥湿健脾除水气，泽泻利水除湿，助脾运化，起辅助作用[9]。其中，芍药的主要药效成分是以芍药苷和芍药内酯苷为代表的单萜苷类成分，具有抗炎、抗氧化、调节免疫作用[10-11]；当归和川芎的主要有机酸类成分均为阿魏酸，具有抗炎、抗氧化、调节代谢、改善认知等作用[12-14]；茯苓的代表性成分为茯苓酸，具有抗氧化、抗凋亡和抗脑缺血等作用[15-16]；泽泻的代表性三萜类成分为24-乙酰泽泻醇A和24-乙酰泽泻醇B，白术的代表性成分为白术内酯Ⅰ，均具有降脂、抗炎和抗凋亡等作用[17-19]。已有研究采用HPLC测定当归芍药散的活性成分[20-21]，但存在精度差、分析时间长、样品处理复杂等缺点，尤其对药物成分含量较低的含药血清极难检测。高效液相谱串联质谱（high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）技术由于前处理方法相对简单，基质干扰小，方法灵敏度高，且兼分离、定量和定性（分子结构信息）于一体，因而特别适用于药物定量和确证分析，可用于中药复方质量控制及中药药理研究中含药血清的质量控制[22-23]。本研究建立测定当归芍药散提取物和含药血清中阿魏酸、芍药苷和茯苓酸含量的HPLC-MS/MS检测方法，用于该方提取物及含药血清的质量控制。1 仪器、试药与动物
Agilent 1290-6460液相谱-串联质谱仪，电喷雾离子源（ESI），Agilent Poroshell 120 EC-C18谱柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm），毕克氮气发生器。N-1100旋转蒸发仪（EYELA东京理化器械株式会社），LGJ-10普通型真空冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司），MixOne涡旋仪（合肥艾本森科学仪器有限公司）。
当归、白芍、茯苓、白术、泽泻、川芎饮片购自湖南中医药大学第一附属医院药剂科。甲醇和乙腈均为谱纯（货号分别为67-56-1、75-05-8，德国默克集团），超纯水（电阻率18.25 Ω•cm，Milli-Q，德国默克密理博），乙酸铵为优级纯（货号631-61-8，国药集团），对照品阿魏酸、芍药苷、茯苓酸（货号分别为SF8030、SP8030、SP8010，HPLC纯度≥98%，北京索莱宝科技有限公司），0.25 μm有机相滤膜（天津博纳艾杰尔科技有限公司）。
雄性SD大鼠10只，SPF级，体质量200～250 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（湘）2013-0004，饲养于湖南中医药大学第一附属医院实验动物中心。动物实验方案通过湖南中医药大学第一附属医院伦理委员会批准（ZYFY20190905）。
2 方法与结果
2.1 当归芍药散提取和冻干粉制备
根据课题组前期研究，采用水提法提取当归芍药散药液并制备冻干粉[7]。按《金匮要略》当归芍药散组方比例（当归14 g，白芍74.4 g，茯苓18.6 g，白术18.6 g，泽泻37.2 g，川芎37.2 g）称取饮片200 g，加5倍量蒸馏水浸泡2 h，武火煮沸0.5 h，文火煮1 h，收集滤液，按上述步骤再次提取，合并2次提取液，用旋转蒸发仪浓缩成浸膏，再用冻干机真空冷冻干燥2～3 d，得到冻干粉。200 g饮片共收集冻干粉25.2 g。
2.2 当归芍药散浓缩液和含药血清制备
称取冻干粉20 g溶于40 mL超纯水，涡旋混匀，定性滤纸过滤，制备0.5 g/mL浓缩液。分别于每日8:00、20:00予大鼠浓缩液6.05 mL/（kg•d）灌胃，相当于24 g原药材/（kg•d），连续7 d。末次灌胃后2 h，3%水合氯醛10 mL/kg麻醉，用负压采血管经腹主动脉采集全血5 mL，静置过夜，3000 r/min离心10 min，收集上清液，0.22 μm滤膜过滤，-80 ℃冻存备用。
2.3 溶液制备
2.3.1 对照品溶液
准确称取阿魏酸、芍药苷和茯苓酸对照品1 mg，用甲醇溶解并定容至1.00 mL，制成1000 μg/mL的对照品贮备液。茯苓酸贮备液用90%甲醇水溶液稀释为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/mL系列对照品溶液，阿
魏酸、芍药苷贮备液用10%乙腈稀释为50、500 μg/mL 混合对照品溶液，再用10%乙腈稀释成阿魏酸和芍药苷浓度分别为0.1、1.0、2.0、5.0、10 μg/mL和1、10、20、50、100 μg/mL的系列混合对照品溶液。
2.3.2 供试品溶液
准确称取0.5 g（精确至0.000 1）当归芍药散冻干粉于10 mL离心管，准确加50%甲醇水溶液5.0 mL，涡旋溶解3 min后10 000 r/min离心5 min，取上清液，过0.25 μm有机滤膜，待测。血清样品用乙腈-0.5 mmol/L 乙酸铵水溶液适当稀释后过0.25 μm有机滤膜，用于茯苓酸测定。
准确称取0.5 g（精确至0.000 1）当归芍药散冻干粉于10 mL离心管中，准确加50%甲醇水溶液5.0 mL，涡旋溶解3 min后10 000 r/min离心5 min，取上清液0.10 mL，用10%乙腈水溶液定容至1.0 mL，过0.25 μm 滤膜，再取该样品溶液0.10 mL，用10%乙腈水溶液定容至1.0 mL，过0.25 μm滤膜，待测。血清样品用乙腈-5 mmol/L乙酸铵水溶液适当稀释后过0.25 μm 有机滤膜，用于阿魏酸和芍药苷测定。
2.4 仪器条件
谱柱：Poroshell 120 EC-C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；茯苓酸流动相：乙腈-0.5 mmol/L乙酸铵水溶液（1∶1，V/V），等度洗脱；阿魏酸和芍药苷流动相：乙腈（B）-5 mmol/L乙酸铵水溶液（A），
梯度洗脱（0～7 min，10%B；7.01～10 min，60%B；10.01～15 min，10%B）；流速：0.4 mL/min；柱温：35 ℃，进样量：5 μL；离子源：电喷雾离子源（ESI），负离子模式；干燥气温度：350 ℃，干燥气流速：12 L/min；干燥气压力：35 psi；检测方式：多反应监测（MRM）。离子源控制条件见表1，定量离子对和定性离子对的相对丰度误差＜10%。
表1 离子源控制条件
化合物定量/定性离子对（m/z）碰撞能/eV 碎解电压/V 阿魏酸定量 193.0→177.8
8
89
定性 193.0→133.8 12 芍药苷定量 479.2→449.0
4
118
定性 479.2→120.9 20
茯苓酸定量 527.4→465.2 44
270
定性 527.4→ 59.1 60
2.5 谱图和质谱图
在同一仪器条件下对供试品和对照品分别进样，得到谱图（见图1～图5）。3种化合物在供试品和对照品中的定量离子对都仅有一个峰，表明方法特异性强，样品中杂质均不产生干扰信号且峰形对称性好。阿魏酸对照品定性离子对（193.0→133.8）与定量离子对（193.0→177.8）的相对丰度为41.3%，在当归芍药散提取液中的相对丰度为41.5%（误差为0.2%），在当归芍药散含药血清中的相对丰度为40.2%（误差为1.1%），误差均小于10%（见图1B、C，图2B、C，图3B、C）；芍药苷对照品定性离子对（479.2→120.9）与定量离子对（479.2→449.0）的相对丰度为50.9%，在当归芍药散提取液中的相对丰度为44.9%（误差为6.0%），在当归芍药散含药血清中的相对丰度为56.0%（误差为5.1%），误差均小于10%（见图1E、F，图2E、F，图3E、F）；茯苓酸对照品定性离子对（527.4→59.1）与定量离子对（527.4→465.2）的相对丰度为69.7%，在当归芍药散提取液中的相对丰度为73.9%（误差为5.8%），误差均小于10%（见图4B、C，图5B、C）。表明检测方法能准确定性当归芍药散提取液和含药血清中阿魏酸、芍药苷和茯苓酸。
2.6 方法学考察
2.6.1 线性关系考察
取阿魏酸、芍药苷和茯苓酸系列对照品溶液进样测定，以所得峰面积为纵坐标，对照品浓度（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，结果见表2。阿魏酸、芍药苷、茯苓酸分别在0.1～20.0 μg/mL、1～100 μg/mL、0.1～20.0 μg/mL范围内线性关系良好，线性宽度可满足样品质量控制的需求。
2.6.2 检出限与定量限
将供试品溶液稀释至3倍信噪比为检出限，10倍信噪比为定量限。阿魏酸、芍药苷、茯苓酸的检出限分别为5、50、5 ng/mL，定量限分别为50、200、50 ng/mL，检出限远低于供试品浓度，可满足对样品的质量控制要求。
注：A.总离子流图；B.阿魏酸定性离子对谱图；C.阿魏酸定量离子对谱图；D.阿魏酸离子对MRM 质谱图；
E.芍药苷定性离子对谱图；
F.芍药苷定量离子对谱图；
G.芍药苷离子对MRM 质谱图
图1 阿魏酸和芍药苷对照品谱及质谱图
注：A.总离子流图；B.阿魏酸定性离子对谱图；C.阿魏酸定量离子对谱图；D.阿魏酸离子对MRM 质谱图；
E.芍药苷定性离子对谱图；
F.芍药苷定量离子对谱图；
G.芍药苷离子对MRM 质谱图
图2 当归芍药散提取液中阿魏酸和芍药苷谱及质谱图
A
B C
D
E
F
G
G
F
E
B C
D
A
t /min
t /min
t /min
t /min
t /min
质荷比（m/z ）
质荷比（m/z ）
0.854
5.701
计数
计数
计数
计数
相对丰度/%
相对丰度/%
计数
计数
计数
计数
计数
计数
5.667
0.881
t /min
t /min
t /min
t /min
t /min
质荷比（m/z ）
质荷比（m/z ）
相对丰度/%
相对丰度/%
注：A.总离子流图；B.阿魏酸定性离子对谱图；C.阿魏酸定量离子对谱图；D.阿魏酸离子对MRM 质谱图；
E.芍药苷定性离子对谱图；
F.芍药苷定量离子对谱图；
G.芍药苷离子对MRM 质谱图
图3 当归芍药散含药血清中阿魏酸和芍药苷谱及质谱图
注：A.总离子流图；B.定性离子对谱图；C.定量离子对谱图；D.离子对MRM 质谱图
张真贺图4 茯苓酸对照品谱及质谱图
A
F
C
B D
G
E
B
C
D
A
相对丰度/%
相对丰度/%
相对丰度/%
0.854
5.570
计数
计数
计数
计数
计数
计数
计数
计数
t /min
t /min
t /min
t /min
t /min
质荷比（m/z ）
质荷比（m/z ）
质荷比（m/z ）
t /min
t /min
t /min
1.583
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