周琦;张宝善;韦露莎;赵育;王颖;裴亚利;付军伟
【摘 要】[目的]探究魔芋飞粉生物碱(Alkaloid from konjac powder,AKP)的抑菌作用及其对大肠杆菌和金黄葡萄球菌的抑菌机理,为新型天然抑菌剂和防腐剂的开发提供理论依据.[方法]采用液体倍比稀释法,确定AKP对大肠杆菌、金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌4株供试菌的最小抑菌质量浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC),并采用牛津杯法测定AKP对上述4株供试菌的抑菌圈大小;通过测定在AKP作用下,大肠杆菌和金黄葡萄球菌的生长曲线、菌体培养液电导率及观察细胞膜完整性、细胞形态等,对AKP的抑菌作用及其机理进行分析.[结果]AKP对4株供试菌均有明显的抑制作用,对金黄葡萄球菌的抑菌作用最强(MIC为10mg/mL),大肠杆菌次之(MIC为20 mg/mL).AKP对供试菌的抑菌圈直径依次为金黄葡萄球菌＞大肠杆菌＞枯草芽孢杆菌＞鼠伤寒沙门氏菌.菌体生长曲线显示,AKP对大肠杆菌和金黄葡萄球菌的生长有明显的抑制效果.AKP作用后,大肠杆菌和金黄葡萄球菌细胞膜受损,存活率显著降低,菌体培养液电导率显著上升.电镜观察发现,AKP使菌体细胞膜出现破损,部分菌体出现空腔.[结论]AKP具有抑菌作用,其可能通过破坏细菌细胞膜结构而导致内容物外泄,进而影响细胞的生长代谢或造成细胞死亡,从而抑制其生长.
【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2019(047)003
【总页数】8页(P121-128)
【关键词】魔芋飞粉;生物碱;抑菌活性;抑菌机理
【作 者】周琦;张宝善;韦露莎;赵育;王颖;裴亚利;付军伟
【作者单位】陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安710119;陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安710119;陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安710119;陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安710119;陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安710119;陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安710119;陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安710119
丁菲飞【正文语种】中 文
【中图分类】TS201.3
魔芋(Konjac)是天南星科魔芋属(Amorphophallus Blume)多年生草本植物，其地下球茎因富含特殊成分葡甘聚糖而广泛应用于食品加工业中。葡甘聚糖是一种品质很好的食用胶体物质，可作为食品增稠剂和凝胶剂[1-3]。加工魔芋时，在风力作用下魔芋粉分离为两部分，重的主要是葡甘聚糖粒子，称为精粉；轻的、细的能被风吹出去的粉质，称为飞粉。飞粉中主要含有碳水化合物、蛋白质、氨基酸、矿物质元素以及少量葡甘露聚糖等成分[4-6]。魔芋飞粉中含有大量的生物碱，含量可达5 g/kg[7]，而生物碱类化合物有一定的抑菌作用[8]。Mabhiza等[9]研究发现，1.67 mg/mL生物碱对金黄葡萄球菌生长的效果与一个标准的氨苄青霉素相当。王关林等[10]报道，苦参碱粗提物可通过抑制鸡大肠杆菌的细胞分裂而抑制菌体的生长。当前，有关魔芋飞粉的开发利用主要集中在生产酒精、提取生物活性物质、饲料生产等研究方面[5,11-13]。据报道，魔芋生物碱在加工过程中被富集于飞粉中[14]，但有关飞粉中生物碱的相关研究较少，所以飞粉价值仍值得深入挖掘。本试验拟从最小抑菌质量浓度、抑菌圈、生长曲线、菌液电导率、荧光染和超微形态结构等方面，系统研究魔芋飞粉生物碱对大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的抑菌规律，分析讨论魔芋飞粉生物碱的抑菌规律和机理，以期为开发和生产新型安全高效的植物源性天然抗菌剂和防腐剂及魔芋飞粉的深入利用与加工提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌种 大肠杆菌(Escherichia coli)CICC 10899、金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CICC 23656、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CICC 10732、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)CICC 21483，均由中国工业微生物菌种保藏中心提供。
1.1.2 魔芋飞粉 于2016-10-05购自陕西省丹凤县凯农魔芋精粉有限公司。
1.1.3 LB液体培养基 每1 000 mL含蛋白胨10 g，酵母粉5 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，pH 7.2。
1.2 主要仪器
Multiskan Go全波长酶标仪，美国Thermo Electron公司；FV1200激光共聚焦显微镜，日本Olympus仪器有限提供；S-3400N扫描电子显微镜，日本Hitachi公司；HT-7700透射电子显微镜，日本Hitachi公司；SDDDSJ-308A型电导率仪，上海志幸科学仪器有限公司。
1.3 魔芋飞粉生物碱(AKP)的制备与鉴定
1.3.1 魔芋飞粉生物碱(AKP)的提取 参考梁引库等[14]的魔芋飞粉生物碱提取方法，用体积分数90%乙醇溶液磁力搅拌提取魔芋飞粉，提取温度70 ℃，提取2次，第1次提取的料液比为1∶8，提取时间2 h。真空抽滤收集滤液，按照上述方法以料液比1∶4进行第2次提取，提取时间2 h，抽滤并回收滤液，合并2次滤液再用微孔滤膜(0.45 μm)真空抽滤并旋转蒸发至浓稠状溶液，冷冻干燥后制得粉状魔芋飞粉生物碱粗提物。
1.3.2 AKP的化学鉴定与含量分析 按照生物碱的定性检出试验[10]进行。取160 mg/mL AKP 1 mL，先加入2滴10 g/mL盐酸使其呈酸性，然后依次使用10 g/L碘-碘化钾溶液、10 g/L饱和溶液、50 g/L饱和水溶液、5 g/L碘化铋钾试剂进行鉴定，有黄或白沉淀产生即判定结果为阳性。以盐酸小檗碱为标准溶液，在414 nm处进行比，测定粗提物中生物碱的质量分数为44.85%。
1.4 AKP抑菌活性测定
1.4.1 最小抑菌质量浓度(MIC)的测定 采用液体倍比稀释法[15]进行。在LB液体培养基中加入
质量分数44.85%的生物碱粗提物，调整生物碱质量浓度分别为0，5，10，20，40，80和160 mg/mL，各取5 mL分装于无菌试管中。将200 μL含量为106～107 CFU/mL的各供试菌分别接于上述试管中，塞上无菌塞。在37 ℃、120 r/min条件下连续振荡培养15 h后，再将培养液划线接于LB固体平板培养基上，于37 ℃恒温培养箱培养24 h，观察细菌生长情况，每组试验设3个重复，确定AKP作用的最小抑菌质量浓度(MIC)。
1.4.2 抑菌圈的测定 采用牛津杯法[10]进行。取含量为106～107 CFU/mL的各供试菌菌液200 μL，均匀涂布于LB固体培养基表面，取200 μL不同质量浓度(0，10，20，40，80和160 mg/mL)的生物碱粗提物分别加入各培养皿的牛津杯中，每个皿中放置3个牛津杯作为重复。在37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，观察抑菌圈大小。
1.5 AKP抑菌机理探究
1.5.1 AKP对菌体生长曲线的影响 调整LB液体培养基中AKP的质量浓度为MIC和1/2 MIC，然后分别接入含有106～107 CFU/mL大肠杆菌和金黄葡萄球菌的菌悬液各200 μL，在37 ℃、120 r/min条件下连续培养15 h，每隔1 h取样测定OD600，以不含AKP的LB液体培养基为对照，绘制大肠杆菌和金黄葡萄球菌的生长曲线，每组设3个重复。
1.5.2 细菌核酸荧光染观察 参考Wu等[16]的荧光染方法。在20 mL LB液体培养基中加入AKP，调整使AKP的质量浓度分别为20和10 mg/mL，以不含AKP的LB液体培养基为对照，在液体培养基中分别加入200 μL含有106～107 CFU/mL大肠杆菌和金黄葡萄球菌的菌悬液，在37 ℃、120 r/min条件下培养3.5 h，5 000 r/min室温条件下离心10 min，收集菌体沉淀。用PBS缓冲液清洗菌体3次，50 μL缓冲液悬浮，在黑暗条件下用荧光探针SYTO9/PI标记。吸取10 μL滴于载玻片上，在激光共聚焦显微镜下观察细菌核酸荧光染。
1.5.3 AKP对菌液电导率的影响 加入AKP使其在液体培养基中的质量浓度为MIC和1/2 MIC，然后分别接入含有106～107 CFU/mL大肠杆菌和金黄葡萄球菌的菌悬液各200 μL，在37 ℃、120 r/min条件下连续培养10 h，参考Li等[17]的方法测定菌液电导率，每小时测定1次，以不含AKP的液体培养基为对照，绘制相对电导率-时间曲线。
1.5.4 扫描电镜观察 参考扫描电镜样品制备方法[18]。按照1.5.1节试验，将AKP处理和未经AKP处理的大肠杆菌和金黄葡萄球菌连续培养15 h后，4 000 r/min室温离心10 min，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤3次，再用体积分数2.5%戊二醛溶液固定2 h，PBS缓冲液洗去戊二醛溶液；然后依次用体积分数30%，50%，70%，90%，100%乙醇梯度脱水，梯度脱水后
用无水乙醇悬浮,每次悬浮后静置10 min。吸取10 μL滴于载玻片上，自然晾干，喷金，在扫描电镜下观察样品的超微形态。
1.5.5 透射电镜观察 参考透射电镜样品制备方法[19]，在用体积分数2.5%戊二醛溶液固定和PBS缓冲液清洗前的试验操作与1.5.4节相同。之后，先用体积分数1%锇酸溶液4 ℃固定2 h，双蒸水冲洗3次，每次10 min，再用体积分数30%，50%，70%，90%，100%的乙醇溶液梯度脱水，每次悬浮后静置10 min，用环氧丙烷置换乙醇2次，每次10 min。最后用纯树脂包埋、切片，在透射电镜下观察样品的超微结构。
1.6 数据分析
利用Microsoft Excel 2010和Origin 8.0软件进行数据处理、绘图，差异显著性水平为P<0.05。
2 结果与分析
2.1 AKP的抑菌活性
2.1.1 最小抑菌质量浓度(MIC) 由表1可见，AKP对4种供试菌的MIC不尽相同，对金黄葡萄球菌所需的抑菌质量浓度最低，其次是大肠杆菌，对枯草芽孢杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的抑菌质量浓度较高，均为40 mg/mL。
表1 AKP对4种供试细菌的MICTable 1 MIC of test strains treated with AKP试验菌种Test strainMIC/(mg·mL-1)大肠杆菌 CICC 10899Escherichia coli CICC 1089920金黄葡萄球菌 CICC 23656Staphylococcus aureus CICC 2365610枯草芽孢杆菌 CICC 10732Bacillus subtilis CICC 1073240鼠伤寒沙门氏菌 CICC 21483Salmonella typhimurium CICC 2148340
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