摘
L .Hill)叶片和根中的亚细胞分布和化学形态。结果表明，续断菊体内大部分的C d 分布在细胞壁中，占40%，且随着C d 浓度的升高，细胞壁中的C d 含量增大，在20m g /L C d 处理下，无论是叶片还是根中，细胞壁中的C d 含量都达到47%，说明续断菊体内的C d 主要贮存在细胞壁中，减少了代谢活跃的细胞器以及膜系统上的C d 含量，从而使续断菊能够耐受高C d 胁迫。C d 处理水平的变化对续断菊C d 的化学形态也有明显的影响，续断菊叶片中的C d 以盐酸提取态和N a C l 提取态为主，根系中N a C l 提取态的C d 含量较高，说明续断菊中的C d 与果胶酸、蛋白质结合，从而也缓解了C d 的危害。
关键词：续断菊；镉（C d ）；亚细胞分布；化学形态秦
丽，李
元，祖艳*，孙会仙
（云南农业大学资源与环境学院，云南昆明650201）
Cd 在续断菊（Sonchus asper L.Hill ）中的
亚细胞分布和化学形态研究
收稿日期：2012－08－07
基金项目：国家自然科学基金（30560034），云南省教育厅基金（2010Y340）。
作者简介：秦丽（1979-），女，讲师，硕士研究生，主要从事土壤重金属污染与修复生态学研究，E -mail ：
qinli29752001@yahoo 。
*为通讯作者，E-mail ：zuyanqun@yahoo 。
Cd 是一种难于控制的污染物，其毒性大、潜伏期
长，且能沿食物链富集，是人们优先考虑去除的污染物
［1～3］
。Cd 的积累能力和生物毒性，不仅与其总量有
关，而且与其形态密切相关，不同的形态产生不同的环境效应。Cd 存在形态的研究，有利于理解其迁移转化机理，阐明其生理作用特征，因此，确定Cd 的活性形态及其影响逐渐成为研究的重点。
植物类型不同对Cd 的解毒机理可能存在很大差异，液泡被认为是多数植物体中贮存Cd 的主要器官［4］，而Cd 超富集植物东南景天吸收的绝大部分Cd 贮存在细胞壁中，可溶态以及细胞器中所含的Cd 较少
［5］
，金属与有机酸、蛋白质间的络合也被认为是很
多植物减少金属对植物毒性的重要途径［6］
。李德
明［7］、周小勇
［8］
采用差速离心技术分别研究了Cd 在
小白菜、Zn 对长柔毛委陵菜（Potentilla griffithii var.
velutina ）体内Cd 的亚细胞分布的影响，都得出2种
作物中Cd 主要分布在细胞壁和可溶组分中。
续断菊（Sonchus asper L.Hill ）是新近发现的一
种Cd 的超积累植物
［7，8］
，对Cd 具有很强的富集能
力。续断菊的发现为Cd 污染土壤的植物修复提供了一种新材料，而对于续断菊超积累及耐性机理的研究则是此项技术走向实用化的基础。
1
材料与方法
1.1
供试材料及培养
试验材料采用云南省会泽县铅锌矿野生植物续断
菊的种子。种子用烤烟专用腐殖土育苗，育苗2个月（长出比较茂盛的根系），选择长势良好且生长一致的幼苗，进行Hoagland 营养液培养实验。
1.2试验设计
营养液组成为Ca （NO 3）2·4H 2O 2.0mmol/L+KH 2PO 4
0.10mmol/L+MgSO 4·7H 2O 0.50mmol/L+KCl 0.10mmol/L+K 2SO 40.70mmol/L+H 3BO 410.00mol/L+MnSO 4·H 2O 0.50
mol/L+ZnSO 4·7H 2O 0.50mol/L +CuSO 4·5H 2O 0.20mol/L+（NH 4）6Mo 7O 240.01mol/L+Fe-EDTA 100mol/L ，Cd
处理设3个浓度（0mg/L 、5mg/L 、20mg/L ），
以
CdC1·2.5H 2O 加入，3个重复，每重复4株，以营养
液连续通气，每4d 更换1次营养液，并用0.1mmol/
L NaOH 调节pH 至5～6，处理40d 后收获。植株根
系先用自来水冲洗，再用20mmol/L Na 2EDTA 交换
20min ，以去除根系表面吸附的Cd ，最后用去离子
水洗净，吸干表面水分，置于-20℃冰箱内供分析测定用。
1.3试验方法
1.3.1植物体内的亚细胞组分分离
按文献［8，9］的方法改进后进行，即准确称取鲜样0.5000g加入20ml提取液[0.25mmol/L蔗糖+50mol/ L Tris-HC1缓冲液（pH7.5）]，研磨匀浆，用尼龙纱布过滤，滤渣为细胞壁部分；滤液在600×g下离心10 min，沉淀为细胞核部分；上清液在2000×g下离心15min，沉淀为叶绿体部分；上清液在10000×g下离心20min，沉淀为线粒体部分；上清液为含核糖体的可溶部分。每组2次离心，全部操作在4℃下进行。
1.3.2Cd在植物体内的化学形态分析
采用化学试剂逐步提取法［10］，具体操作如下：准确称取鲜样0．5000g，加入20ml提取液研磨匀浆后转入50ml的塑料离心管，在25℃恒温振荡22h后，5000r/min离心10min。倒出上清夜，再加入10ml 提取液，25℃恒温振荡1h，5000r/min离心10min，倒出上清液。合并2次上清液。采用下列5种提取剂依次逐步提取：80％乙醇，主要提取醇溶性蛋白质、氨基酸盐等为主的物质；去离子水，主要提取水溶性有机酸盐；1mol/L氯化钠溶液，主要提取果胶酸盐、与蛋白质结合态或吸附态的重金属等；2％醋酸，主要提取难溶于水的重金属磷酸盐；0.6mol/L盐酸，主要提取草酸盐等。剩下的为残留态。
2结果与分析
2.1Cd在续断菊亚细胞中的分布
在不同浓度Cd处理下，Cd在续断菊亚细胞中的分布及各部位所占比例如图1所示。在Cd处理浓度为0mg/L时，续断菊叶片中的Cd主要贮藏在细胞壁和叶绿体中，两者之和占总量的52%，在细胞核、线粒体和核糖体中分布较均匀，均维持在16%左右；Cd 在根系中的分布顺序为细胞壁＞细胞核＞线粒体＞核糖体＞叶绿体，细胞壁占总量的39.6%，细胞壁和细胞核占总量的61.3%（图1A）。在Cd浓度为5mg/L时，续断菊叶片中的Cd主要贮藏在细胞壁中，占总量的33.2%，其次为叶绿体、细胞核、线粒体、核糖体；而根系中Cd的分布顺序为细胞壁＞细胞核＞叶绿体＞线绿体＞核糖体，细胞壁占总量的38.
1%（图1B）。在Cd处理浓度为20mg/L时，叶片中的Cd主要集中在细胞壁和细胞核中，两者占总量的79.5%，核糖体中分布较少，仅有1.8%；根系中Cd也是主要集中贮藏于细胞壁和细胞核中，两者占总量的70.5%，其余为线粒体、叶绿体、核糖体，和Cd浓度为5mg/L时稍有不同，而且叶片和根系中Cd在核糖体中的分布较少（图1C）。
图１不同Ｃｄ处理下Ｃｄ在续断菊亚细胞中的分布
2.2Cd在续断菊中的化学形态
从表2和图2可以看出，在Cd处理浓度为0mg/
L时，续断菊叶片中Cd的化学形态分布比较均匀，
根系中NaCl提取态的Cd含量较高，达到37.69mg/
kg，占总量的34.2%。在Cd处理浓度为5mg/L、20
mg/L时，续断菊叶片和根系中Cd的化学形态均有所
增加，其中在叶片中均以HCl提取态的Cd含量增加
较为明显；在根系中均以醋酸、氯化钠提取态的Cd
含量增加较为明显。在Cd浓度为5mg/L时，叶片中
HCl提取态的Cd含量较Cd=0增加了9.06mg/kg，根
系中醋酸提取态的Cd含量较Cd=0增加了13.75mg/
kg；在Cd浓度为20mg/L时，叶片中HCl提取态的Cd含量较Cd=0增加了33.04mg/kg，占总量的33.2%，根系中醋酸提取态的Cd含量较Cd=0增加了27.46mg/kg，氯化钠提取态的Cd含量较Cd=0增加了
图２不同Ｃｄ处理下续断菊中Ｃｄ的形态分配比例
叶根
Cd0mg/L Cd5mg/L Cd20mg/L
表２不同Ｃｄ处理下续断菊中Ｃｄ的化学形态
注：表中的结果为平均值±标准差。同一列的不同字母表示用Duncan 法测试时5％水平上的差异性显著。
73.61mg/kg ，占总量的47.2%。3
讨论与结论
3.1
讨论
一般来说不同的金属在植株的不同部位贮藏量大不
相同，Cd 的分布因植物种类的不同而不同，Davies ［11］对几种草本植物的研究结果发现，65%～90%的Cd 贮存在根部；Perronnet 等
［12］
对目前公认的Cd 超累积
植物遏蓝菜（T.caerulescens ）的研究结果表明，94%的Cd 分布在地上部，90%的Zn 分布在地上部。
对于超富集植物来说，液泡被认为是植物体中贮存Cd 的主要器官［4,13］
，细胞壁是重金属进入细胞内
部的第一道屏障
［13,14］
。细胞壁属于细胞内的非原生质
部分，细胞壁上的多糖分子（包括纤维素、半纤维素、木质素和粘胶等）和蛋白质分子具有大量的羟基、羧基、醛基、氨基等亲金属离子的配位基团，这些金属配位体能与进入细胞的金属离子结合，从而减少金属离子的跨膜运输，降低细胞原生质体内金属离子的浓度，维持植物细胞的正常生理代谢［14,16］
，在超积累植物体内，有85％～90％的重金属离子是与这些
金属配位体结合形成螯合物
［17］
。因此，重金属在植物
体内的分布和存在形态是与多种金属配位体综合反应的结果。有研究表明，在Berkheya coddii 叶片的上表皮中贮存的Ni 比其他任何地方都高
［18］
。Nishzono ［19］
发现，Athyrium yokoscense 细胞壁中积累大量Cd ，并占整个细胞总量的70%～90%。Molone 等［20］在电子显微镜下证明了细胞壁有沉淀重金属的作用。Ni 等
［5］
发现东南景天（Sedum alfredii Hance ）吸收的绝大部分Cd 贮存在细胞壁中，可溶态以及细胞器中所含的
Cd 较少。Wu 等
［12］
对不同植物研究的结果表明，植
物地上部分的Cd 主要存在于细胞壁中。本实验研究结果表明，在Cd 浓度为0mg/L 时，续断菊叶片和根
系贮藏Cd 的部位有所不同，叶片的主要部位是叶绿体，根系的主要部位是细胞壁，而Cd 浓度为5mg/L
、
20mg/L 时，续断菊叶片和根系均以细胞壁为贮藏Cd
的重要部位，叶绿体和线粒体中Cd 的含量相对较低，这保证了续断菊光合作用和呼吸作用的正常进行，在根系中，核糖体贮藏的Cd 较少，这与周小勇［8］等对圆锥南芥（Arabis paniculata Franch ）的研究结果相反，说明Cd 的分布因植株的种类不同而不同。
通过不同提取剂，研究Cd 在植物体内的存在状态，对植物富集重金属的机理有一定的揭示作用。水提取态主要是水溶性有机酸结合的Cd ，乙醇主要提取与醇溶性蛋白质、氨基酸盐等结合的Cd ，NaCl 提取态则是与果胶酸、蛋白质结合或吸附的Cd 。本研究结果表明，Cd 处理水平的变化对续断菊Cd 的化学形态有明显的影响，随Cd 浓度的升高，续断菊叶片中Cd 的化学形态分布变化很大，主要的存在状态均有所不同，但在根系中的主要存在状态变化不大，均以Na -
Cl 、醋酸提取态为主。Cd 与有机酸结合形成的螯合物
可限制金属在体内的移动性，减轻毒害
［21］
，植物不
同，有机酸的作用效果不同，用20mg/L Cd 处理超富集植物T.caerulescens ，在根部有13％的Cd 与有机酸结合
［21］
。在Cd 胁迫下，植物诱导出特定的蛋白质
（多肽），并与之结合，从而减轻毒害。植物螯合肽（Phytochelatin ）便是富含半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸的多肽
［22］
，由GSH 经酶促合成
［23］
，金属硫蛋白
（Metallothioneins ，MT ）也是富含半胱氨酸的蛋白质［24］
，这些物质在续断菊对Cd 的解毒过程中的作用尚需进一步研究。
3.2结论
（1）在不同浓度Cd 处理下，续断菊叶片富集Cd
的部位有所不同，但主要贮存在细胞壁、细胞核和叶绿体中，而根系富集Cd 的的部位主要分布在细胞壁
Cd 处理（mg/L ）
部位
Cd 含量（mg/kg ）
乙醇
水
氯化钠
醋酸
盐酸
残渣态
0叶
16.85±0.28bB
15.79±0.31bC 14.70±0.36bD 14.50±0.30bD 13.59±0.31bE 17.61±0.56bA 517.13±0.09abB 16.50±0.45bB 15.85±1.22bB 15.55±0.97bB 22.75±3.79bA 18.2±0.48abB 2017.43±0.20aC 17.53±0.30aC 37.28±2.96aB 21.24±1.70aC 55.79±7.49aA 18.94±0.46aC 512.88±1.84bE 16.70±0.17b 38.17±1.24bA 28.88±2.03bB 14.71±0.88aDE 18.36±0.35aC 20
17.60±0.20aC
18.18±0.94aC
111.78±6.54aA
56.34±7.36aB
15.00±1.63aC
18.73±0.54aC
011.10±0.72bD
14.38±0.17cC 37.69±1.13bA 15.13±0.96cC 13.91±0.16aC 18.00±0.27aB 根
和细胞核中。
（2）Cd处理浓度的变化对续断菊Cd化学形态有明显的影响，随Cd浓度的升高，续断菊叶片中Cd的化学形态分布变化很大，主要存在状态均有所不同；但在根系中的主要存在状态变化不大，均以NaCl、醋酸提取态为主。
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