一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法
含氮有机物与浓硫酸共热,即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸铵。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：
H2NCH2COOH+ 3H2SO4 ® 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)
中国家庭主题曲2NH3 + H2SO4 ® (NH4)2SO4 (2)
(NH4)2SO4 + 2NaOH ® 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。
二、双缩脲法（Biuret法）
牛莉丈夫蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中，蛋白质与Cu2+形成紫络合物，此紫络合物颜的深浅与蛋白质含量成正比，而与蛋白质的相对分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1～10ug蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
假如我不曾爱你 我不会失去自己三、Folin—酚试剂法（Lowry法）
这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂配制较为困难，近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显反应产生深蓝的原因是：?在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。?Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝（钼蓝和钨蓝的混合物）。在一定的条件下，蓝深度与蛋白的含量
成正比。
Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸钠（1%），硝酸钠（1%），三（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显测定。若样品酸度较高，显后会浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。
进行测定时，加Folin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。
此法也适用于酪氨酸和氨酸的定量测定。
此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20～250mg。
四、紫外吸收法
由于蛋白质分子中，酪氨酸和氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度与蛋白质含量成正比，可用作定量测定。
紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，利用280nm进行紫外检测，来判断蛋白质吸附或洗脱情况是最常用的方法。
此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。
此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。
五、考马斯亮兰法（Bradford法）
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰由465nm变为595nm，溶液的颜也由棕黑变为蓝。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是：
（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋
白质与染料结合后产生的颜变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷
基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。
（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
赵丽颖生宝宝了吗六、BCA比法
在碱性溶液中，蛋白质将Cu2+还愿为Cu+再与BCA试剂（4，4´-二羧酸-2，2´-二喹啉钠）生成紫复合物，于562nm由最大吸收，其强度和蛋白质浓度成正比。此法的优点是单一试剂、终产物稳定，于lowry法相比几乎没有干扰物质的影响。尤其是在TritonX-100，SDS等表面活性剂中也可以测定。其灵敏度范围一般在10～1200 ug/ml。
表 五种蛋白质含量测定方法的比较
方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明
凯氏定氮法
（Kjedahl法） 灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为 ±2％ 费时
8～10小时 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三沉淀蛋白质而分离） 用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长
双缩脲法（Biuret法） 灵敏度低
十一届全运会主题曲1～20mg 中速
20~30分钟 多肽键＋碱性Cu2＋®紫络合物 硫酸铵；
Tris缓冲液；
某些氨基酸 用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显相似
紫外吸收法 较为灵敏
50～100mg 快速
5～10分钟 蛋白质中的酪氨酸和氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶；
各种核苷酸 用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正
Folin－酚试剂法（Lowry法） 灵敏度高
～5mg 慢速
40～60
分钟 双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 硫酸铵；
Tris缓冲液；
甘氨酸；
各种硫醇 耗费时间长；操作要严格计时；
颜深浅随不同蛋白质变化
考马斯亮蓝法(Bradford法) 灵敏度最高
1～5mg 快速
5～15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液；
TritonX-100;
SDS 最好的方法；
不是因为寂寞才想你简谱干扰物质少；
颜稳定；
颜深浅随不同蛋白质变化
从以上表格中可以得出，不同的方法有不同的特点和优势，如紫外吸收法测定时间快。但是综合起来，最后一种考马斯亮蓝法(Bradford法)效率最高，无论是测定时间，灵敏度还是受干扰程度，都是比较占优势的。
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