技术方法名称  紫外分光光度计测定DNA 、RNA 和蛋白质
基本原理  分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。
1.光的基本知识
光是由光量子组成的，具有二重性，即不连续的微粒和连续的波动性。波长和频率是光的波动性和特征，可用下式表示：
式中λ为波长，具有相同的振动相位的相邻两点间的距离叫波长。Ｖ为频率，即每秒钟振动次数。Ｃ为光速等于299770千米／秒。光属于电磁波。自然界中存在各种不同波长的电磁波，列成表1-1所示的波谱图。 分光光度法所使用的光谱范围在200 nm-10 μ（1 μ= 1, 000 nm ）之间。其中200 nm －400 nm 为紫外光区，400 nm －760 nm 为可见光区，760 nm －10,000 nm 为红外光区。
2.朗伯－比尔（Lambert-Beer ）定律
朗伯－比尔定律是比分析的基本原理，这个定律是有溶液对单光的吸收程度与溶液及液层厚度间的定量关系。此定律是由朗伯定律和比尔定律归纳而得。炫木
朗伯定律
一束单光通过溶液后，由于溶液吸收了一部分光能，光的强度就要减弱：若溶液浓度不变，则溶液的厚度愈大（即光在溶液中所经过的途径愈长），光的强度减低也愈显著。  朗伯－比尔定律
如果同时考虑吸收层的厚度和溶液浓度对光吸收的影响，则必然将朗伯定律和比尔定律合并起来，吸光度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比，这就是朗伯－比尔定律。  紫外分光光度计测定核酸
1.基本原理
核酸样品浓度的测定
Ｃ λ ＝ Ｖ ───
核酸样品纯度的测定
对于纯净的样品，A260 / A280的比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA），A260 / A230的比值大于2.0，A320一般是0。
2.实验材料
比杯因为是在紫外区测定核酸，因此应采用石英比杯。测定时，不能用手指拿比
李秉宪宋慧乔爆缸事件
杯的光学面，用后要及时洗涤，可用温水或稀盐酸，乙醇以至铬酸洗液（浓酸中浸泡不要超过15 min），表面只能用柔软的绒布或拭镜头纸擦净。
黄河颂歌曲3.溶液配制
测定样品的纯度时，建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液（测定DNA样品时，
需无菌处理；测定RNA样品时，则需灭活DNase 和RNase ）稀释样品，如10 mM Tris-Cl,
pH 7.5。因为水没有缓冲能力，pH 和A260 / A280的比值易受影响而变化很大。pH 降低将
导致A260 / A280的比值下降，从而降低对蛋白污染的敏感性。缓冲液的离子强度太高也会导
致读数漂移。
测定样品的浓度时，建议使用去离子水（测定DNA样品时，需无菌处理；测定RNA样
品时，则需灭活DNase 和RNase）稀释样品。因为只有当用水稀释样品时，A260和浓度之间的换算关系才能成立。
有多少爱可以重来伴奏4.实验设计
测定样品在各个波长（230、260、280、330nm）下的光吸收，同时以空白样品作为对
照。从A260 / A280、A260 / A230、A320的比值判定样品的纯度。当样品的纯度达到要求时，根据A260的数值计算出样品的浓度。
5.操作步骤及每步需注意的事项
略。
6.结果观察及分析的原则
tor saksit
结果的观察及分析的原则已体现在基本原理和实验设计中。
RNA样品纯度的测定280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。当R>1.82时，说明RNA中蛋白或者其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，
当用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是<2.2的）。当R<1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定要不要使用这份RNA（不同的实验对RNA质量的要求不同）。当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。
7.实验成功或失败的关键因素潘霜霜三围
✧由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测
试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。
✧混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，
否则读数漂移剧烈。
✧必须使用相同的比杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大。
✧不能采用窗口磨损的比杯。
✧样品的体积必须达到比杯要求的最小体积。
紫外分光光度计测定蛋白质
1.蛋白质的直接定量（UV法）
蛋白质在280 nm左右有吸收高峰，这主要是由于蛋白质中的芳香族氨基酸（氨酸Trp 和酪氨酸Tyr）的缘故，因此可以用280 nm光吸收值来定量溶液中的蛋白质。但是每种蛋白质中的芳香族氨基酸含量是不同的，而且有较大的差别。最简单的是采用280 nm 光吸收为1 时等于1 mg/ml 来计算。这样简单的处理在准确上有不足之处，但其测定迅速，用量极少，而且不消耗样品，故被广泛采用。
考虑到蛋白质样品中可能含有少量核酸杂质，因此采用280 nm和260 nm光吸收以下式计算：蛋白质浓度（mg/ml）= (1.55×A280)-(0.76×A260)。
对于抗体和BSA，可按下述标准计算其浓度：
蛋白质A280(1mg/ml)
IgG    1.35
IgM    1.2
BSA0.7
最准确的方法是用蛋白质的摩尔吸光系数计算。在蛋白质纯化后，将此纯的蛋白质对水充分透析，然后冻干或在真空干燥器中干燥，继而在105℃下恒重，精确称量1～10 mg，再定量溶于一定体积中（通常为1 mg/ml），测定280nm下的光吸收，从而得出该蛋白质的克
分子消光系数。这种方法最为方便、准确，也很微量。
2．比法蛋白质定量
蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显基团或者染料反应，产生有物质。有物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。比方法一般有BCA、Bradford、Lowry 等几种方法。
Lowry 法以最早期的Biuret 反应为基础，并有所改进。蛋白质与Cu2+ 反应，产生蓝的反应物。但是与Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂；反应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含EDTA，TritonX-100，ammonia sulfate 等物质的蛋白不适合此种方法。
BCA（Bicinchoninine acid assay）法这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2+反应产生Cu+，后者与BCA 形成螯合物，形成紫化合物，吸收峰在562 nm 波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极强，反应后形成的化合物非常稳定。相对于Lowry 法，操作简单，敏感度高。但是与Lowry 法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。
Bradford法这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有化合物吸收峰595 nm。其最大的特点是，敏感度好，是Lowry 和BCA 两种测试方法的  2 倍；操作更简单，速度更快；只需要一种反应试剂；化合物可以稳定１小时，方便结果；而且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的。最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。
实验成功或失败的关键因素
某些初次接触比法测定的研究者可能为各种比法测出的结果并不一致，感到迷惑，究竟该相信哪
种方法？由于各种方法反应的基团以及显基团不一，所以同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度无可比性。例如：Keller 等测试人奶中的蛋白，结果Lowry，BCA 测出的浓度明显高于Bradford，差异显著。即使是测定同一样品，同一种比法选择的标准样品不一致，测试后的浓度也不一致。如用Lowry 测试细胞匀浆中的蛋白质，以BSA 作标准品，浓度1.34 mg/ml，以  a 球蛋白作标准品，浓度2.64 mg/ml。因此，在选择比法之前，最好是参照要测试的样本的化学构成，寻化学构成类似的标准蛋白作标准品。
比法定量蛋白质，经常出现的问题是样品的吸光值太低，导致测出的样品浓度与实际的浓度差距较大。关键问题是，反应后的颜是有一定的半衰期，所以每种比法都列出了反应测试时间，所有的样品（包括标准样品），都必须在此时间内测试。时间过长，得到的吸光值变小，换算的浓度值降低。