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基础研究
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爱情从告白开始的歌曲中国临床药理学与学中国药理学会主办!"#$ %&'()*，+,,"%''- &.'%
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收稿 &'&& %& %'修回
H 8:IJ2&&#$'##.&(L ii4578余勤，通信作者，男，汉族，主任医师，教授，博士生导师，研究方向：睡眠呼吸暂停与慢性间歇缺氧。
H 8:IJ2KOi@'%L%(#4578
细胞焦亡介导慢性间歇缺氧大鼠肾脏损伤及依达拉奉的干预作用
杨治安%
，赵岩&
，何瑶&
，刘维英#
，余勤
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甘肃省人民医院呼吸与危重症医学科干部病区，兰州@#''''，甘肃；
&
兰州大学第一临床医学院，兰州@#''''，甘肃；#
兰州大学第一医院呼吸与危重症医学科，兰州@#''''，甘肃
摘要 目的：探究依达拉奉对慢性间歇缺氧导致
大鼠肾脏损伤的保护作用及其对!:N1:NP %介导的细胞焦亡信号通路的影响。方法：&$只,c_级
亲爱的你要好好的雄性,W 大鼠随机分为正常对照（"!）组、
间歇缺氧（+C ）组、间歇缺氧h 生理盐水（+C h ",）组、间歇缺氧h 依达拉奉（+C h HWX ）组，每组(只。将$组大鼠放置在密闭式饲养舱内造模，"!组舱内氧气浓度维持在&%Y 左右，+C 组、+C h "，组、+C h
HWX 组定时输入纯氧气、
纯氮气、压缩空气，使舱内形成缺氧 复氧循环（('N 低氧期h ('N 复氧期），低氧期舱内氧浓度降至(Y ～@Y ，每日造模=
/（
%'∶'' %=∶''），同时+C h HWX 组大鼠每天造模前按照.8Z)MZ 剂量标准予以腹腔注射依达拉奉，+C h "，组大鼠按照同等剂量标准腹腔注射生理盐水。造模=周后采集大鼠血液标本及肾脏组
霍建华微博织标本，测定各组大鼠血肌酐（!TP:）、
尿素（fTP :）水平；CH 、]:NN7；染后光镜下观察肾脏病理形态变化、纤维化程度；化学法测定丙二醛（]WX ）含量、超氧化物歧化酶（,^W ）活力；免疫组织化学染法测定肾组织"B*c#、!:N1:NP %、+B %β蛋白表达水平；APN0PT;aJ70法测定肾组织
!:N1:NP %、+B %β
蛋白表达水平；*S c!*法测定消
皮素W （Z:NQPT8I;WR `,W]W ）、+B %=8*"X 扩增水平。结果：间歇缺氧暴露后，大鼠血清!TP:、f
TP：明显升高（ U '4'%）
，肾小管发生病理损害、肾单位球囊间隙出现胶原纤维沉积，]WX 含量增加、,^W 活力降低（ U '4'%），!:N1:NP %、"B*c#、+B
%β蛋白表达增加（ U '4'%或 U '4'.）、`,W]W 8*"X 、+B %=8*"X 扩增增加（ U '4'%）
；
而经过依达拉奉干预后，上述指标呈现出与间歇低氧暴露后相反的变化趋势，肾脏病理损害减轻（ U '4'%或 U '4'.）。结论：慢性间歇缺氧可能通过氧化应激活化!:N1:NP %参与的细胞焦亡信号通路介导肾脏损伤过程，而依达拉奉可能通过清除氧自由基、下调机体氧化应激水平，抑制焦亡通路的活化，起到保护肾脏的作用。关键词 间歇缺氧；肾脏损伤；细胞焦亡；氧化应激；依达拉奉
中图分类号：*&.(4%<*.(#
文献标志码：X
文章编号：%''- &.'%>&'&#?'% ''%' '-Q7I ：%'4%&'-&)64INN;4%''- &.'%4&''%4''&
目前研究认为，慢性间歇缺氧导致的氧化应激性损伤是阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（7aN0TO50IeP NJPP1:1;P:/K171;P:NK;QT78PR
^,XC,）
引起肾脏损害的主要机制，其可以使肾脏局部出现无菌性炎症反应。而近年来，细胞焦亡引起了大家的广泛关注，前期相关研究发现，作为介导无菌性炎症反应的重要机制之一，焦亡信号
·
０１·
通路在肾脏急、慢性损伤进程中发挥了重要作用，无论是在梗阻性、缺血再灌注性急性肾损伤［% &］，还是膜性肾病、+ZX肾病、狼疮性肾炎等慢性肾脏病中［# $］，肾组织中"B*c#)X,!)1T7!:N1:NP %（"^W JIMP TP5P107T1T70PI;#):17107NIN :NN75I:0PQ N1P5M JIMP1T70PI;57;0:I;I;Z:5:N1:NP TP5TOI0 8P;0Q78:I;)1T7 5KN0PI;KJ:N1:T0:0P N1P5I[I51T7 0PI;:NP%）焦亡小体都表达上调，而线粒体来源的活性氧自由基（TP:50IeP7dIQP N1P5IPNR*^,）已被证实是激活"B*受体蛋白#（"^W JIMP TP5P107T 1T70PI;#R"B*c#）受体的重要介质［.］。本课题拟探究细胞焦亡是否介导参与慢性间歇缺氧导致肾损伤的病理过程，同时应用自由基清除剂依达拉奉进行药物干预，判断其能否通过抑制细胞焦亡信号途径来减轻肾脏局部炎症反应，从而延缓^,XC，相关的肾损害，起到保护肾脏的作用。! 材料与方法
!"! 实验动物 ,c_级健康雄性,W大鼠，=周龄，体质量#&'～#('Z，共计&$只，购自兰州大学实验动物中心，批号：,!FE（甘）&'&' '''&，饲养于兰州大学基础医学院遗传病学实验动物房。将大鼠置于安静、自然光照、温度（&'～&(℃）及湿度（$.Y～('Y）适宜的环境中使用同种水源、饲料及垫料适应性饲养%周。大鼠在饲养舱内自由活动、自由饮食水，无外界不良刺激和干扰。动物使用和护理程序都按照兰州大学实验动物指南进行，并且经过动物伦理委员会批准。!"# 实验主要试剂 生物素 链酶卵白素免疫组化检测试剂盒、WXD显液购自北京中杉金桥生物技术有限公司；"B*c#抗体（aN %''&
小鹿个人资料%*）、+B %β抗体（aN '=%&*）购自北京博奥森生物技术有限公司；!:N1:NP %抗体（GS.@$#）购自I88O;73:K公司；,PTeI5PaI7 *S_ITN0,0T:;Q5W"X,K;0/PNIN EI0、&×,GD*`TPP;l15T]:N0PT]Id（B7d*^F）、引物购自武汉赛维尔生物科技有限公司；丙二醛（8:J7;QI:JQP/KQPR]WX）测试盒、超氧化物歧化酶（NO1PT7dIQP QIN8O0:NPR,^W）测试盒购自南京建成生物工程研究所；]:NN7；染试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；H!B化学发光试剂盒（c''%=_,）购自碧云天试剂公司；依达拉奉注射液由兰州大学第一医院呼吸科提供。!"$ 动物分组 造模前%天将&$只,W大鼠称重，采用随机数字表法将其按照体质量区间分为正常对照组（;PZ:0IeP57;0T7JR"!）、间歇缺氧组（I;0PT8I00P;0/K17dI:R+C）、间歇缺氧h生理盐水组（I;0PT8I00P;0/K17dI:h;7T8:J N:JI;PR+C h ",）、间歇缺氧h依达拉奉组（I;0PT8I00P;0/K17d I:h PQ:T:e7;PR+C h HWX），每组各(只。!"% H*模型制备 参考文献中关于+C大鼠模型制作的方法［( @］，+C模式设定为低氧与复氧交替，%&'N为一个周期（('N低氧期h('N复氧期）。将各组大鼠分别置于密闭式大鼠饲养舱中，该舱配备通畅的气体流入道和流出道，向+C组、+C h "，组、+C h HWX组饲养舱前#'N输入纯氮气，使舱内氧浓度快速由&%Y降至(Y～@Y，之后为%'N 静息期，无气体输入，保证舱内氧浓度维持在(Y
～@Y，形成低氧环境；而后&'N快速向舱内输入纯氧气，使氧浓度快速恢复至&%Y左右，持续输入
压缩空气('N，保证舱内氧浓度维持在&%Y左右，形成复氧环境，此模式不断循环；"!组饲养舱始终输入压缩空气，保持常氧环境，气体输入时间、输入流量同另外三组；造模过程中，利用!G %&!测氧仪
随时检测各组舱内氧浓度并随时调整。造模时间为每日%'时至%=时，其余时间$组大鼠均饲养于同温度、同湿度、同氧浓度、同喂养环境中。+C h HWX组大鼠在每天造模开始前，先称量体质量，后按照.8Z)MZ剂量标准腹腔注射药物浓度为&8Z)8B的依达拉奉注射液，+C h"，组按照相同剂量标准腹腔注射生理盐水，注射完毕后观察实验动物，有无不良反应，造模过程持续=周，此过程中无实验动物死亡。
!"& 组织处理与标本采集 造模=周后，将大鼠禁食水=/，称量体质量后进行腹腔麻醉（%'Y水合氯醛#8B)MZ），真空采血管采取主动脉血约&
8B送至兰州大学第一医院检验科，用于检测血清尿素、肌酐水平。取血后，快速打开腹腔，经主动脉反复灌洗肾脏，快速暴露大鼠左右肾脏并由肾蒂离断取出，在冰板上去除包膜，将左肾置于#Y 的多聚甲醛溶液中固定用于CH染、]:NN7；染和免疫组化检测，取右肾组织并置于预先标记好的冻存管中，经液氮速冻后保存于－='℃冰箱中，用于氧化应激指标,^W、]WX测定、*S c!*、APN0PT;aJ70检测焦亡相关蛋白的表达。
·１１·
中国临床药理学与学&' :;<&=>%?
!
"I 肾脏组织病理染 CH染：肾脏组织石蜡包埋后切片，片厚#μ8，进行常规CH染后滴加中性树胶封片，显微镜%''、&''倍镜下观察；]:N
N7；染：石蜡包块切片，片厚#μ8，利用]:NN7；染试剂盒染，%''、&''倍光镜下观察。!"W 肾脏组织中LOP、NPJ测定 将肾组织从－='℃冰箱中取出，称取一定量后加入'4-Y的生理盐水，制备成浓度约为%'Y的匀浆液后立即放入高速离心机离心，%'8I；后去取上清液，采用黄嘌呤氧化酶法测定,^W活力、采用硫代酸法测定]WX含量。
!"X 免疫组化法检测肾脏组织'8?>8?1 !、SRMY$、HR !β的表达 石蜡包块连续切片，片厚#μ8，烤片（恒温箱('℃，$/），常规脱蜡、水化，高压锅枸橼酸（1C g(）热修复(8I;，自然冷却后行内源性过氧化物酶阻断、正常山羊血清封闭处理，后滴加!:N1:NP %一抗（%∶%''）、"B*c#一抗（%∶%''）、+B %β一抗（%∶&''），$℃孵育过夜，复温'4./后，二抗室温孵育%.8I;，滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液室温孵育%.8I;，WXD显、苏木素复染后依次分化、反蓝、脱水，滴加中性树胶封片。分别置于%''、&''倍光镜下观察并采集图片，+8:ZP9软件进行灰度计算与半定量分析（X^W g+^W)XTP:）。
!"Z V1?31=5:;43法测定'8?>8?1 !、HR !β的表达
提取肾组织总蛋白后，D!X蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白含量，各组蛋白上样量为.'μZ，进行
%'Y十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至聚偏氟乙烯膜，.Y脱脂牛奶室温封闭%/，兔抗大鼠!:N1:NP %一抗（%∶%'''）、+B %β一抗（%∶%'''）
$℃孵育过夜，山羊抗兔+Z`（%∶.'''）室温孵育% /，H!B显影，暗室曝光，检测特异性蛋白条带。蛋白相对表达为目的基因灰度值)内参基因β :50I；灰度值。
!"!+ M( Y'M测定消皮素P（.8?E1=F-5P[\LP NP）、HR !X FMSJ `,W]W、+B %=、内参`XcWC引物用W"X!JOa软件设计，具体序列如下：`,W]W 上游引物.n `X`S!S!XX`S!X`XS``XX!!XXS #n，下游引物.n !`X`!X!!X`X!X!S!XX``XS #n；+B %=上游引物.n XX!X`!!XX!`XXSX`X! #n，下游引物.n SS`SSSSSX!X``X`X```SX`X!X #n；内参`XcWC上游引物.n !S``X`XXX!!S`!!XX`SXS` #n，下游引物.n ``S``XX`XXS```X`SS`!S #n。反应条件为：（%）预变性（-.℃，%'8I;）；（&）c!*反应（$'个循环，-.℃下%.N、('℃下#'N）；（#）(.
℃→-.℃（每升温'4.℃，采集一次荧光信号）。每个样品设置#个复孔，分别得到熔解曲线、扩增
曲线，使用表达倍数g& △△!S计算各组`,W]W、+B %=8*"X水平。
!"!! 统计学方法 采用,c,,,0:0IN0I5N&.4'软件对本实验数据进行统计分析，计量资料的数据以均数±标准差（ ± ）来表示，所有数据首先进行正态分布和方差齐性检验，多组间比较采用单因素方差分析法分析，两两比较采用B,W检验。 U '4'.表示差异有统计学意义。
# 结果
#"! 各组大鼠血清中肌酐、尿素指标的变化 $组大鼠间血清中尿素、肌酐差异均有统计学意义（ U'4'%），+C组和+C h"，组与"!组相比，尿素、肌酐差异均有统计学意义（ U'4'%）；+C组与
+C h"，组相比，肌酐差异无统计学意义（ o '4'.）；+C h HWX组与+C组、+C h"，组相比，尿素、肌酐差异有统计学意义（ U'4'%）。具体结果见
S:a4%。
#"# 各组大鼠肾组织中LOP活力、NPJ含量变化 $组大鼠间肾组织中,^W活力、]WX浓度差
异均有统计学意义（ U'4'%），+C组和+C h"，组与"!组相比，,^W活力下降、]WX浓度升高，差异均有统计学意义（ U'4'%）；+C组与+C h"，组相比，,^W活力、]WX浓度差异无统计学意义（ o'4'.）；+C h HWX组与+C组、+C h"，组相比，,^W 活力有所回升、]WX浓度有所下降，差异有统计学意义（ U'4'%或 U'4'.）。具体结果见S:a4%。#"$ 各组大鼠肾脏病理结构的变化
&4#4% CH染 "!组肾脏组织镜下肾小球、肾小管、系膜形态基本正常，未见明显异常；+C组、+C h"，组与"!组相比，镜下可见肾小管管腔扭曲，肾小管上皮细胞排列紊乱，个别管腔出现狭窄、甚至闭塞，而肾小球未见明显异常，充盈良好；+C h HWX组局部肾小管管腔仍有扭曲，结构较"!组排列
较紊乱，但肾小管管腔狭窄程度较+C组、+C h"，组有所减轻，见_IZ4%所示。
·２１·!/I;9!JI;c/:T8:57J S/PT&' :;<&=>%?
(8:"! '4F>8=-?4540=158;06523-4585E4C-E83-D1?3=1??-5E1C1?8F45..=46>?@ ± A IB
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&4#4& ]:NN7；染评估各组大鼠肾脏纤维化程度差异 +C组、+C h"，组与"!组相比，肾小球
与肾小囊构成的球囊间隙可见胶原纤维沉积增加，肾小管基底膜侧管周间隙纤维化程度不明显，而管腔侧蓝染物质明显增加，此部分可能为管腔内蛋白沉积，不作为纤维化的证据；+C h HWX组与+C组、+C h"，组相比，纤维化程度改善不明显，在球囊间隙仍然可见蓝染物质沉积，见_IZ4&
所示。,-."# HF8.140>8394;4.-28;2985.1?40=158;3-??61@N8??45?38-5-5.[×#++[?28;1A!++μFB
#"% 免疫组化法检测各组大鼠肾脏组织中'8?>8?1 !、SRMY$、HR !β表达 如_IZ4#X所示，"B *c#、!:N1:NP %两种蛋白在肾小管上皮细胞、集合管亮、暗细胞胞质中高度表达，而在肾小球和肾间质中则表达较少，而+B %β可见在肾小管上皮细胞内外、集合管细胞内外及肾间质中均有表达。三种蛋白在"!组、+C组、+C h"，组、+C h HWX组$组间表达量差异有统计学意义（ U'4'%），+C组和+C h"，组与"!组相比，各蛋白表达量明显增加，差异均有统计学意义（ U'4'%）；+C组与+C h"，组相比，各蛋白表达量差异无统计学意义（ o
'4'.）；+C h HWX组与+C组、+C h"，组相比，"B *c#、!:N1:NP %、+B %β三种蛋白表达量均明显减少，阳性信号主要沉积在肾皮质区集合管管壁细胞内，差异有统计学意义（ U'4'%）。具体分析结果见_IZ4#D。以上结果说明，间歇缺氧刺激下焦亡
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中国临床药理学与学&' :;<&=>%?
相关蛋白"B*c#、!:N1:NP %、+B %β在肾小管上皮细胞及集合管管壁细胞中表达明显增加，而依达拉奉可以抑制以上蛋白在肾小管上皮细胞中的表
达，减轻该部位损伤，但对集合管的损伤保护效果
不明显。,-."$
X2: ;:JKNIN TPNOJ0N "!ZT7O1<[!U #"&
'8?>8?1 !$D 所示）与"!计学意义（!U '4'%或!U '4'.）；+C 组与+C h "，组相比，表达量差异无统计学意义（!o '4'.）；+C h HWX 组与+C 组、+C h "，组相比，!:N1:NP %、+B %β蛋白表达量明显减少，差异有统计学意义（!U
儿歌mtv下载'4'.）
，此结果同免疫组化分析结果一致。、`,W
组与+C h "，组相比较，差异无统计学意义（!o
'4'.）；经过依达拉奉干预后，相比于+C 组与+C h "，组，+C h HWX 组`,W]W 、+B %=8*"X 表达有所
下调，差异均有统计学意义（!U '4'%）
，具体结果见_IZ4.。
·４１·!/I;9!JI;c/:T8:57J S/PT &' :;<&=>%?
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