细菌毒力岛的研究进展
1　毒力岛基本特征及分类
1.1基本特征
毒力岛(virulenceisland)又称致病性岛(pathogenicity island),是近年来在细菌分子学研究领域出现的新概念。1997年Hacker等对毒力岛下了较为精确的定义:即毒力岛是编码细菌毒力基因簇的一分子量相对较大的染体DNA片段。毒力岛具有下列基本特征[1～4]:(1)编码细菌毒力基因簇的一个相对分子质量较大的(20～100k左右)染体DNA片段。(2)一些毒力岛的两侧具有重复序列和插入元件,但是也可以没有。(3)演员李明毒力岛往往位于细菌染体的tRNA基因位点内或附近,或者位于与噬菌体整合有关的位点,肠致病性大肠杆菌(EPEC)的LEE毒力岛就位于转运RNAselC位点[2,3]。(4)有缘人dj毒力岛DNA片段的G+Cmol%、密码使用和宿主细菌染体有明显差异,有的比宿主细胞的G+Cmol%明显高,有的明显低。(5)毒力岛编码的基因产物许多是分泌性蛋白和细胞表面蛋白,如溶血素、菌毛和血红素结合因子,一些毒力岛编码细菌的分泌系统(如Ⅲ型分泌系统)、信息传导系统和调节系统。(6)一种病原菌可以有一个或几个毒力岛。(
7)一部分学者认为,细菌的毒力岛应该包括位于噬菌体和质粒上的、与细菌的毒力有关的、其G+C百分比和密码使用与宿主细胞明显不同的DNA片段。(8)毒力岛可能与新发现的病原性细菌有关。
1.2　分类
目前发现的毒力岛根据其G+C百分比与宿主菌的差异,电话情缘米娜可分成两类:即高G+C毒力岛,如小肠结肠炎耶尔森菌的毒力岛；低G+C毒力岛,如大肠杆菌、沙门氏菌以及幽门螺杆菌中的毒力岛。根据毒力岛编码的产物性质可分为致病性岛和共生岛两大类。
2　结构与功能
2.1　结构
毒力岛是由独特的DNA片段构成,其不同来源的毒力岛的分子量、密码使用、听爸爸的话mvG+C百分比各异。毒力岛主要含有与细菌毒力有关的基因,此外,RS和IR在毒力岛上也比较常见,而且,IR的类型也多种多样。大多数毒力岛在染体上的位置与tRNA位点相邻或位于其中,tRNA位点的序列保守,其二价对称的结构又为插入酶提供了适宜的结合部位,常常作为质粒、噬菌体和
毒力岛DNA片段插入染体的位置。因此,细菌毒力岛可能也是外源性基因借助于可移动性的载体成分进入细菌胞浆内并插入到染体上的特殊位置,从而赋予宿主菌某些新的毒力特征。尽管从结构特征上认为毒力岛是外源性的DNA,但目前尚未发现其染体外的存在形式,细菌的毒力岛究竟来源于何处,以什么为载体、在不同细菌之间如何进行水平转移及其机制尚需深入研究。
2.2　功能
毒力岛虽然都是编码毒力相关基因的DNA大片段,但其产物却因不同的细菌而有差异。有的毒力岛具有编码Ⅲ型分泌系统的基因,对致病菌侵袭宿主上皮细胞以及在巨噬细胞内的存活具有重要意义。除了编码Ⅲ型分泌系统外,细菌的毒力岛还编码一些表面蛋白(如菌毛、环境感受器等)和外毒素。毒力岛除了某些结构基因外,还含有调控成分,使其在赋予宿主细菌一些新的毒力特征的同时,还调控着其他毒力因子的功能,有时同一病原菌上的两个毒力岛之间也存在着基因的互相调控。
3　致病性细菌的毒力岛
过去,人们往往认为细菌毒力是单因素的,或者说其中的某一个毒力因子发挥着决定性的作用。例如,过去认为弧菌的毒力主要是产生毒素的能力,不产生毒素的细菌就是无毒的。毒力岛的发现使我们认识到细菌的毒力比我们想象的要复杂的多[5]。目前已经发现的毒力岛有10多个。
3.1　大肠杆菌　
肠致病性大肠杆菌(EPEC)是幼畜和婴儿腹泻的一类重要病原菌,其主要特征是能在感染家畜和婴儿的肠上皮细胞或在组织培养细胞表面形成特征性的组织病理学损伤,这种损伤叫做粘附与脱落损伤(A/E),形成A/E损伤所必需的基因位于EPEC的LEE乐器演奏毒力岛上,这种损伤的病理学变化是细菌与肠上皮细胞紧密粘附,肠微绒毛消失,并使细菌粘附部位的肠上皮细胞骨架发生改变,丝状肌动蛋白聚集等。后来发现肠出血性大肠杆菌(EHEC)在肠道也引起相同的A/E损伤,因而将这几类大肠杆菌称为A/E大肠杆菌(A/li,AEEC)。随着研究的深入, 发现引起A/ E损伤所必需的所有基因都位于大肠杆菌染体上一个35kb的致病岛区域内，称为肠细胞脱落位点(LEE),或LEE毒力岛。此外，目前大量的研究表明，大肠杆菌还具有耶尔森氏菌强毒力岛(HPI)。
3.1.1  LEE致病岛的结构特点
    LEE致病岛中最初被发现的基因是eae基因，Jerse等首先构建了EPEC E2348/69的TnphoA突变子，从而使突变菌株丧失了A/E表型。随之Donnenherg等构建了另外一种突变菌株，他们使eae基因下游5kb位点处的基因突变，也使之丧失了A/E表型，最初把这个基因叫做eaeB，后来被命名为espB。 McDaniel等构建了另外一些突变子，也可以使A/E表型丧失，他们研究发现，利用转座子突变破坏的基因都位于35kb区域内,EPEC,EHEC以及其它A/E病原菌都有这个基因区,而大肠杆菌K-12菌株，正常菌的大肠杆菌以及ETEC菌株则没有。
    LEE是位于染体上的编码毒力因子的基因，它含有编码A/ E损伤的所有基因以及其它一些毒力基因。LEE含有的基因主要包括以下几种类型：编码Ⅲ型分泌系统(esc或sep基因)，分泌型蛋白质( esp基因)及其分子伴侣，外膜蛋白紧密素(eaeA基因)和紧密素易位受体(tir)等基因。
    除从人体分离的EPEC菌株外，从其它家畜体内分离出的EPEC也含有LEE致病岛。Joffaux等从狗和猫体内分离出了EPEC菌株，用分布在LEE致病岛上不同位置的四个探针
进行杂交，结果表明这些菌株染体上都含有LEE致病岛，并用PCR的方法克隆到了eae，esp，sep和tir的同源基因。Fairbrother等还从猪体内分离出了EPEC，DNA探针杂交表明所有导致A/E损伤的猪EPEC菌株都有LEE致病岛。Karaolis等还从引起兔腹泻的RDEC-1中克隆到LEE，并进行了分析，结果表明RDEC-1 LEE与E2348/ 69 LEE无论是大小还是结构都非常相似。
最近，Elliott等测出了EPEC E2348/ 69菌株LEE致病岛的全序列，并进行了初步分析。详细的资料可以在GenBank(进入号AF022236)bi.v上查到。E2348/69菌株的LEE全长有35,624bp, G+C含量为38. 36%，这比大肠杆菌全基因组G+C含量50.8%低得多。LEE共含有41个开放性阅读框(open reading frames, ORFs)，至少有4个多顺反子(polycistronic operon)控制这些ORF。
    从遗传学的角度来看，LEE致病岛表现出的一些特征说明LEE是一个外源性片段，它是细菌在进化过程中获得的，这些特征包括:（1）LEE的G+C含量(38. 36%)远远低于大肠杆菌染体DNA的G+C含量(51%)；（2）致A/E损伤的病原菌中的LEE致病岛都具有高度的保守性；（3）LEE序列可以在大肠杆菌K-12菌株染体上大约82min处插入，这也是硒代
半胱氨酸(selenocysteine, Se1C)tRNA的位点，同时也是尿道致病性大肠杆菌的溶血素(hemolysin，hly)基因和P相关菌毛的插入位点，这说明这个位置是外源基因插入的热点位置；（4）在LEE序列最右端还残留有转座酶基因的遗迹。Sperandio等最近从大肠杆菌Olllac: H-血清型LEE两端克隆并鉴定了有插入序列的存在，这也支持了上面的观点。
    最近，Pernas等还报道了EHEC O157:H7 EDL933血清型LEE致病岛的全序列有43359bp( GenBank进入号AF071034),G+C含量为40.91%,共含有54个开放性阅读框。对这两个菌株的LEE进行比较分析，发现EHEC中有13个命名为933L的ORF属于P4前噬菌体家族，EPEC则不含这些ORF。其余的41个ORF也与这两个菌株相同。二者LEE致病岛上的基因有95%的同源性。
    EPEC E2348/ 69菌株的LEE在其两端缺少直接重复序列，也没有明显的噬菌体序列。EHEC0157: H7的LEE在一端含有一个溶原性噬菌体，但后者很可能是在LEE插入到细菌染体之后才整合到LEE中。
3.1.2  LEE致病岛上的主要致病基因
3.1.2.1 eae基因
引起A/E损伤最主要的一个基因就是eae (E. coli attaching and effacing)基因，EPEC的eae基因位于LEE致病岛上的第22个开放性阅读框，即orf22。eae基因最先是由Jerse等用TnphoA突变体的方法鉴定并报道的。eae基因是引起A/E损伤所必需的，在所有能引起A/ E损伤的EPEC, EHEC,弗氏柠檬酸菌和蜂房哈夫尼菌等中都检测到eae基因或其同源序列，而在不引起A/E损伤的正常肠道大肠杆菌、ETEC等菌中则没有这种序列。eae基因的突变菌株虽然也能粘附组织培养细胞的刷状缘，但不能引起A/E表型的超微结构变化。
eae基因编码一个94kDa的外膜蛋白即紧密素(intimin)，紧密素属于细菌细胞粘附分子家族，它可介导细菌与肠上皮细胞进一步紧密粘附。不同菌株产生的紧密素之问具有显著的同源性，尤其是在紧密素的N-端区域。
    核苷酸序列分析表明EPEC E2348/69菌株的eae基因是一个含有2817bp的开放性阅读框，编码一个含939个氨基酸残基的蛋白质分子，从氨基酸残基计算出的分子量为102.4kDa。Jerse等对实验室感染的志愿者进行免疫实验证明EPEC eae基因编码的是一个94kDa的外膜蛋白(紧密素)，这与从核苷酸水平计算得出的102.4kDa不符，究其原因可能是由于对信号肽进行翻译后加工所引起的。
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    EHEC 0157: H7 EDL933菌株的eae基因是一个2802bp的开放性阅读框，编码一个含934个氨基酸残基的蛋白质，其计算出的分了量为102.0kDa。
    EPEC和EHEC eae结构基因在核苷酸水平和氨基酸水平上分别有86%和83%相同，这两个基因的5’端同源性非常高。在N一端的704个氨基酸残基(占整个蛋白质氨基酸残基的75%)中无论在核苷酸水平还是氨基酸水平上都有94%相同，剩下的25%序列中在核苷酸水平有60%相同，在氨基酸水平有49%相同。位于EPEC与EHEC的eae基因起始密码了上游的序列也有很高的同源性，它们含有相同的启动子和核糖体结合位点。在它们eae基因3’端有一个对称区域，这可能是rho依赖的转录终止了信号。
    实验表明针对EHEC紧密素的抗血清能够阻止EHEC对HEp-2细胞的粘附，但此血清对EPEC E2348/ 69菌株感染不具有作用。同时针对E2348/69菌株紧密素的抗血清也不能与EHEC菌株作用。这表明EPEC和EHEC的eae基因编码的紧密素虽然都可以介导细菌紧密粘附宿主细胞并产生A/E损伤，但它们的抗原决定簇都位于紧密素蛋白质同源性非常低的C-末端。
3.1.2.2  tir基因
tir基因紧位于eae基因前面，它编码Tit蛋白，即紧密素易位受体(translocated intimin receptor)。最初人们把Tit当作是宿主细胞膜上的一个酪氨酸磷酸化的蛋白质而叫做“Hp90”。后来发现Tit是由细菌LEE编码的一个分子量为90kDa的细菌蛋白质，它由Ⅲ型分泌系统分泌后经转运进入上皮细胞细胞膜，插入到膜蛋白中，然后经过磷酸化后作为紧密素的受体。Tit可能也是一种成核肌动蛋白，它在细菌和宿主细胞骨架问可能起一种桥梁的作用。还有报道Tit也能引起宿主炎症反应。
    在tir和eae基因之间是cesT(以前叫(orfU)基因,它编码着Tit蛋白的一种分子伴侣蛋白(chaperone)。cesT在所有已知的引起A/ E损伤的病原菌中都具有高度的保守性，这可能是因为在此阅读框内具有eae的转录起始位点。