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【摘要】在最近几年中，食源性疾病高发，饮食成为了人们面临的重要课题。研究表明，在食源性疾病传播中，病毒有着重要地位。诺如病毒(Norovirus，NoV)是一种杯状病毒，是导致急性病毒性肠胃炎发作的重要因素，容易在一些集中的场所爆发，比如学校、医院、餐馆等。在本文中，分析了诺如病毒主要的检测技术，同时分析了技术使用的优点和缺点，希望给诺如病毒之后的研究带来参考。
【关键词】食品；诺如病毒；检测；技术
一、核酸检测
（一）RT-qPCR
在诺如病毒检测中，分子RT-qPCR检测是其“金标准”，有着很强的敏感性和特异性，能够快速检测到粪便和其环境中的诺如病毒核酸，同时能够对病毒载量进行测定。在测序PCR产物时，能够判断诺如病毒基因型。吕慧仪个人资料
过程：（1）提取病毒RNA：使用德国QIAGEN公司的QIAamp Vial RNA Mini kit试剂盒，采用柱纯化技术，操作步骤按试剂盒说明书进行，最后以30μL洗脱液洗脱。（2）荧光定量RT-PCR法检测：实验反应体系采用上海之江生物科技有限公司Norwalk Virus Real Time RT-PCRkit。操作步骤按试剂盒说明书进行相对定量检测，用MJ Re-search Option2荧光定量PCR分析仪，最后根据检测样品的RT-PCR反应体系扩增曲线在FAM检测通道有无对数增长期或Ct值判定是否阳性:1无对数增长期或Ct值≥37，判为阴性;2有对数增长期且Ct值≤35，判为阳性。3有对数增长期且3535，判为阴性。该试剂盒能同时检测GI和GⅡ型，最低度检测限103 copies/mL。
RT-qPCR能够在单一反应内放大信号，对荧光信号进行实时检测，从而实现定量效果。在实际中，该检测方式有着很强的特异性，并且灵敏性高，是当前检测NoV的“金标准”。这种检测方法灵敏度能达到103DNA拷贝数/mL，同时也不会和其他肠道病毒产生交叉反应，分析灵敏度高。RT-qPCR是当前使用最为普遍的检测方式，其特异性很强、灵敏度高，然而却难以将致病性以及非致病性诺如病毒颗粒区分开来，在食品样品基质内，有很多分子检测抑制剂，同样会影响到检测的结果。因此，很多研究将其和其他技术综合起来分析，比如先使用PGM，分离活性病毒粒子，然后再使用RT-qPCR。
（二）数字PCR
微滴式数字PCR在使用中首先微滴化处理样品，其中产生荧光信号判读为1，否则为0，按照阳性微滴比例判断结果。ddPCR不需要依靠外部曲线标准，突破了Ct值局限，成为了一种可以代替RT-qPCR的方式。同时，其使用有着很高的灵敏度，不会被基质抑制，能够精准检测，是十分理想的检测方式。在当前，更多研究集中在数字PCR上，在食源性致病微生物检测中有着显著的优势。然而其设备十分昂贵，影响着技术的应用，相信在未来的发展中，随着仪器成本的降低，这种检测方法能够得到很好的普及。
草原晨曲伴奏（三）二代测序技术
二代测序（NGS）主要是在基因芯片和PCR上产生的，是DNA测序的一种，该技术能够对DNA复制的流程进行记录，测序其中新添加碱基包含的特殊标记，有着高速、高通量的优势。一般RT-PCR只可以对NoVRNA存在进行简单的检测，很难分辨出是感染性或者是非感染性的病毒颗粒。为了防止非感染性病毒颗粒出现假阳性的问题，要实施样品的RNase预处理。研究表明，NGS技术的应用能够对冷冻浆果内的致病性病毒进行检测。二代测序技术能够鉴别分析一些罕见和常见的NoV变异序列，在分型溯源中有着显著的优势。另外，
该方法要进一步进行优化，大大减少其中的干扰序列，要求能够在高度丰富的核酸条件下更加方便检测，比如DNases处理样品。
二、免疫学检验
免疫学检验是使用特异性抗体对样本内的NoV进行检测。使用量化或检测分析物的不同标记方式，又可以划分成不同的类型，在当前，主要检测诺如病毒的技术方法包含免疫层析技术和ELISA。
（一）免疫层析技术
免疫层析技术主要是基于免疫渗滤逐渐发展形成的新型免疫学检测方式。在样品中如果有相应抗原，就会和抗体产生特异性反应，检测线展现出能够看见的条带。免疫层析有着很长的保质期，同时其检测时间短、成本低等等，很多商业免疫层析试剂盒也得到了广泛的应用。在Kumthip的研究中，对最新的诺如病毒免疫层析试剂盒进行了验证，测试了其在诺如病毒检测中的特异性和敏感性，同时和RT-PCR技术做出了对比。结果表明，该试剂盒的应用有着很强的特异性和灵敏度，同时和一些胃肠炎病毒不会产生交叉反应。因为免
疫层析技术的特异性低、灵敏度差，因此其分型NoV的能力不足，多数应用在临床样本检测中。但可将其与其他技术联合以提高检测的灵敏度，从而满足食品中NoV的检测要求。
（二）ELISA
ELISA技术的应用能够把抗体或抗原结合在固相载体表面，之后添加酶标抗体或抗原，在抗原抗体产生特异性结合下，酶催化底物就会显，这就实现了检测的目标。ELISA检测方式容易操作、检测时间短等等。在临床中，很多商业ELISA试剂盒都得到了广泛的应用。比如英国的Dako Cytomation公司研发了IDEIATM诺如病毒试剂盒，德国也研发了该技术，然而这些试剂盒应用中的特异性和灵敏度存在很大差距，同时可能产生假阳性的情况，影响了其推广和使用。在食品中如果NoV的量少，然而ELISA检测的最低浓度是104病毒颗粒/g，这就无法满足低浓度的检测使用。
ELISA和另外一些免疫学检测方法相同，其特异性和灵敏度低，最低的检测浓度是104～106个病毒颗粒/g，无法满足食品基质内的NoV检测。在当前，一些新技术层出不穷，这给食品内NoV检测带来很大帮助。在最近的研究中，将近红外荧光和免疫层析法综合起来，设置了一种便携式试纸条，能够检测贝类中的诺如病毒。当前新型的免疫分析方法主要是
在纳米材料基础上，可以检测黄瓜、鸡肉和生菜内的诺如病毒。在当前，免疫学技术和其他技术的综合使用显著提高了检测的效率，大大增强了检测的灵敏度，能够更好地符合食品中诺如病毒的检测需要，同时检测操作十分方便。
站台简谱三、生物传感器
生物传感器的应用原理是把生物响应转变成能够进行测量的光、电以及物理信号，包含了理化转换系统和生物刺激性材料识别元件。按照应用信号转换器的不同，生物传感器又可以划分成为光学、电化学、半导体生物传感器和压电晶体。该设备使用的灵敏度高、成本低廉、分析快等等，有着很强的集成化和自动化，这些也都成为研究的重点。
（一）电化学生物传感器
电化学生物传感器是一种将生物识别转换为电流、电位、阻抗等电信号的传感平台，具有低成本、高灵敏度的特点。在Baek研究中，使用NoroBP-nonFoul-(FlexL)2多肽作为一种结合剂，研发出了电化学生物传感器。NoroBP多肽可以和NoV特异性结合。该多肽包含巯基，能够生成Au—S共价键把多肽包在电极上，在这种情况下，随着病毒的增加，电流信
号呈现出递减趋势。电化学生物传感器检测的敏感度高，同时其下限在1.7拷贝数/mL，有着很高的灵敏度，特别实在牡蛎样品中的应用，能够实现6.21拷贝数/mL的检测。
NoV衣壳蛋白检测和诺如病毒样颗粒都能够实现间接的。Guo等研发出了一种光电化学生物传感器，主要进行特异性检测。在这个该传感器中，电极光电流能够跟随NoV的衣壳蛋白浓度出现变化，能够半小时内使用浓度依赖形式检测到2×10-10g/mL的NoV衣壳蛋白。另外，Lee在研究中应用了外加磁力，把金/磁性纳米颗粒修饰的石墨烯沉积在叉指式铂电极上作为电传感通道，之后和GII型NoV抗体偶联，成为病毒颗粒传感平台。这个传感平台的使用能够对毒样颗粒的变化使用电阻变化形式表现出来，检测限是1.16pg/mL。电化学生物传感器有着很高的灵敏苏，同时也是新型工具，能够进行快速诊断，增强检测的灵敏性，然而在实际中，并没有进行普及和推广。
（二）光学生物传感器
光学生物传感器包含类型众多，同时需要使用的样品少，具有无标记的特点，其特异性和灵敏度都很多，可以进行实时检测，在诺如病毒检测中有着很大的应用潜力。在实际中，局域表面等离子体共振是使用最多的传感方式，能够快速响应，同时其衰变长度短等等，
能够对物体表面的分析物进行高精度检测。Heo等应用这项技术研发了人源NoV的传感器，主要是由亲和肽引导的。亲和肽能够在多价M13随机肽库内筛选出来，和NoV产生特异性结合，在ELISA鉴定后，其和NoV结合的亲和力是纳摩尔级别。NoV衣壳蛋白含量和LSPR信号中的吸光度呈现正比，同时其最低检测限是0.1ng/mL。然而在实际的LSPR传感中，必须要对反应条件进行严格的控制，减少非特异性结合，配体在传感器表面固定之后，就会导致天然构型产生变化，影响到和分析物之间的结合。另外，荧光的光学传感器也能够应用到食品的诺如病毒检测中。
除了光学生物和电化学的传感器，另外还有很多生物传感器也都可以进行诺如病毒的检测，比如比型生物传感器、基于质量的生物传感器（石英晶体微天平和微悬臂梁）、免疫传感器等。在这些检测方法中，生物传感器的应用优势最显著，比如其成本低廉、使用的样品量很少、有着很高的灵敏度、能够快速进行分析等等，在检测食品内的诺如病毒方面有着突出的优势。然而虽然生物传感器的应用有着众多的优势，能够大大提高检测灵敏度，然而在实际中并没有推广和普及，并且使用配体捕获NoV时，有时会对配体天然构象造成改变，阻碍了其和分析物的结合，因此必须要在未来进行改进。
四、结束语
诺如病毒是导致急性胃肠炎的主要病原，因为其生物学特性突出，十分容易造成食品污染。检测食品内的诺如病毒能够给诺如病毒胃肠炎的防治带来基础和保障。在长期的研究中，食品诺如病毒检测技术也获得了很大的发展，人们对其基因分型、病学特征和检测诊断等等有了更为全面的认识。然而在当前的诺如病毒检测技术中，依然存在很多不足和挑战，必须要深入研究。
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