保护作用
吴惠文，姚心琪，鲁静浩，姜慧霞
我要夏天山西医科大学汾阳学院科技中心，山西汾阳０３２２００
及甘氨酸的保护机制。方法采用１０％的果糖溶液喂养大鼠复制ＩＥＴＭ模型，同时给予甘氨酸干预。分别于２月、４
月末处死动物，检测血浆内毒素（ＬＰＳ）及肠组织ＩＡＰ水平；Ｈ＆Ｅ及Ｇｏｍｏｒｉ染检测肠肠黏膜屏障变化与ＩＡＰ表达，
分析ＬＰＳ与ＩＡＰ的相关性。结果与对照组相比，模型组２月、４月血浆ＬＰＳ水平明显升高（P＜０．０１），肠组织ＩＡＰ
表达明显降低（P＜０．０１），肠黏膜屏障发生损伤；甘氨酸干预对上述变化有明显改善作用（P＜０．０５）；ＬＰＳ与ＩＡＰ水
平负相关（r s＝０．６６，P＜０．０５）。结论果糖饮食致大鼠肠黏膜屏障损伤是发生ＩＥＴＭ的原因之一；甘氨酸通过促进肠
ＩＡＰ表达，减轻肠黏膜屏障损伤可明显改善ＩＥＴＭ。
关键词：果糖饮食；甘氨酸；肠源性内毒素血症；肠型碱性磷酸酶；肠黏膜屏障
中图分类号：Ｒ１５文献标志码：Ａ文章编号：１００３－８５０７（２０１５）１６－２９１７－０３
Protective effect of glycine on intestinal endotoxemia induced by fructose
diet in rats
ＷＵＨｕｉ－ｗｅｎ，ＹＡＯＸｉｎ－ｑｉ，ＬＵＪｉｎｇ－ｈａｏ，ＪＩＡＮＧＨｕｉ－ｘｉａ
Science and technology center of Fenyang college,Shanxi medical university,Fenyang,Shanxi032200,China
Abstract:ObjectiveＴｈｅａｉｍｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗａｓｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＩＡＰ）ａｎｄｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ
ｍｕｃｏｓａｌｂａｒｒｉｅｒｉｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａ（ＩＥＴＭ）ｉｎｄｕｃｅｄｂｙｆｒｕｃｔｏｓｅｄｉｅｔ，ａｎｄｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｇｌｙｃｉｎｅ．MethodsＴｈｅｍｏｄｅｌ
ｇｒｏｕｐｒｅｃｅｉｖｅｄ１０％ｆｒｕｃｔｏｓｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，ａｎｄｔｈｅｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｇｒｏｕｐｒｅｃｅｉｖｅｄ１０％ｆｒｕｃｔｏｓｅａｎｄ１％ｇｌｙｃｉｎｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ
ａｎｉｍａｌｓｗｅｒｅｓａｃｒｉｆｉｃｅｄｉｎｔｈｅ２ｎｄｍｏｎｔｈａｎｄｔｈｅ４ｔｈｍｏｎｔｈ．ＰｌａｓｍａＬＰＳａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＡＰｉｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｔｉｓｓｕｅｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄ．
ＴｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａｌｂａｒｒｉｅｒａｎｄＩＡＰｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＨＥａｎｄＧｏｍｏｒｉｓｔａｉｎｉｎｇ．ＴｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＬＰＳａｎｄＩＡＰ
ｗｅｒｅｃａｌｃｕｌａｔｅｄ．ResultsＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆＬＰＳｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ（P＜０．０１），ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ
ＩＡＰｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ（P＜０．０１），ａｎｄｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａｌｂａｒｒｉｅｒｗａｓｄａｍａｇｅｄｉｎｔｈｅ２ｎｄｍｏｎｔｈａｎｄｔｈｅ４ｔｈｍｏｎｔｈｏｆ
ｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈｇｌｙｃｉｎｅｐａｒｔｉａｌｌｙａｍｅｌｉｏｒａｔｅｄｔｈｅｃｈａｎｇｅｓ（P＜０．０５）．ＴｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆＩＡＰｗｅｒｅｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈＬＰＳ
（r s＝０．６６，P＜０．０５）．ConclusionＴｈｅｄａｍａｇｅｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａｌｂａｒｒｉｅｒｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＩＥＴＭｉｎｄｕｃｅｄｂｙｆｒｕｃｔｏｓｅｄｉｅｔ，
ａｎｄｇｌｙｃｉｎｅｈａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｂｙｐｒｏｍｏｔｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＡＰａｎｄａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇｔｈｅｄａｍａｇｅｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａｌ
ｂａｒｒｉｅｒ．
Keywords:Ｈｉｇｈ－ｆｒｕｃｔｏｓｅｄｉｅｔ；Ｇｌｙｃｉｎｅ；Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａ；Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａｌｂａｒｒｉｅｒ
肠黏膜屏障损伤致内毒素（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ，ＬＰＳ）吸收增加及肝脏枯否细胞吞噬功能下降是形成肠源性内毒素血症（ＩｎｔｅｓｔｉｎａｌＥｎｄｏｔｏｘｅｍｉａ，ＩＥＴＭ）的主要原因。动物实验研究表明，ＩＥＴＭ是促发多种代谢性疾病的始动因素之一［1，2］。本实验室前期研究发现，甘氨酸对果糖饮食所致的ＩＥＴＭ有明显改善作用［1］。肠型碱性磷酸酶（ＩｎｔｅｓｔｉｎａｌＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＩＡＰ）主要表达于肠上皮细胞微绒毛的顶端。研究认
基金项目：山西省研究生优秀创新项目（Ｎｏ．２０１０３０５２），山西省高等学校大学生创新创业训练项目（Ｎｏ．２０１２３９４）421谁写的
作者简介：吴惠文，男，博士，副教授，研究方向：内毒素与代谢疾病为，ＩＡＰ在维持肠道内环境稳定及肠黏膜屏障结构完整中发挥着重要作用［3，4］。本研究旨在阐明果糖饮食致大鼠发生ＩＥＴＭ时，肠壁ＩＡＰ表达及肠黏膜屏障的变化，探讨甘氨酸改善ＩＥＴＭ的可能机制。
1材料与方法
1.1试剂β－甘油磷酸钠为上海丽臣生物科技公司产品，硝酸钴购自南京化学试剂公司，硫化铵溶液购自青岛鑫鹏化工公司，钠购自河北化工鑫和公司，ＬＰＳ试剂盒购自厦门鲎试剂实验厂。1.2动物分组、处理雄性ＳＤ大鼠（体重２３０～２４０ｇ）购自山西医科大学动物中心，随机分为４组，
2.2肠黏膜屏障变化由图１可见，对照组与甘氨酸组肠黏膜结构完整，绒毛整齐，上皮细胞形态正常。模型组２月表现为肠黏膜绒毛间隙加宽，４月出现绒毛与固有膜分离，上皮细胞成片脱落，甚至肠壁仅留固有层。甘氨酸干预可减轻模型组上述病理损伤。见图１。
每组８只。对照组给予正常饮食，果糖模型组饮用１０％果糖溶液，干预组饮用１０％果糖＋１％甘氨酸溶液，甘氨酸组饮用１％甘氨酸溶液。大鼠自由饮水、进食（标准大鼠饲料）。分别于２月、４月末处死大鼠，１％钠腹腔注射麻醉，腹主动脉抽血后离心分离血浆；取小肠上段，纵向切
开后生理盐水冲洗，部分样本固定于１０％福尔马林及冷丙酮（４℃）溶液１２～１８ｈ，备作组织学检测，其余样本－８０℃冷冻保存。
1.3检测指标与方法
1.3.1ＬＰＳ检测采用鲎试剂显法进行，该法检测敏感性为０．００１（ＥＵ）／ｍｌ～１（ＥＵ）／ｍｌ。ＬＰＳ检测均使用无热源材料并按试剂盒说明书进行。诚实地想你
1.3.2肠黏膜屏障变化检测取福尔马林溶液固定后的肠组织，常规石蜡包埋切片，切片厚度为５μｍ，Ｈ＆Ｅ染，镜下观察肠黏膜屏障变化。
1.3.3肠ＩＡＰ活性表达及定位取冷丙酮溶液固定的肠组织，采用改良Ｇｏｍｏｒｉ法检测肠组织ＩＡＰ的表达，ＩＡＰ阳性表现为棕黑颗粒沉淀。
1.3.4肠ＩＡＰ水平检测取肠组织按１∶５（Ｗ／Ｖ）比例加入生理盐水匀浆，４℃离心（１６０００ｒ／ｍｉｎ，ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ－５４１５Ｒ）１５ｍｉｎ，分离上清液后采用磷酸苯二钠法检测ＩＡＰ水平。
1.4统计学处理数据采用ＳＰＳＳ１４．０进行分析。计量资料用均数±标准误（x±s）表示，采用Ｓｐｅａｒｍａｎ法计算血浆ＬＰＳ与肠组织ＩＡＰ的相关性，其他数据采用单因素方差分析。以α＝０
．０５为检验水准。
2结果
2.1血浆ＬＰＳ变化与对照组比较，模型组２月、４月血浆ＬＰＳ水平明显升高（P＜０．０１），说明模型组发生ＩＥＴＭ。甘氨酸干预可显明显低模型组血浆ＬＰＳ水平（P＜０．０５）。甘氨酸组与对照组比较，血浆ＬＰＳ变化差异无统计学意义（P＞０．０５）。见表１。
韩国最高颜值限制禁片注：Ａ：对照组，Ｂ：模型组２月，Ｃ：模型组４月，Ｄ：干预组２月，Ｅ：干预组４月。
图1不同组大鼠肠黏膜屏障结构变化（Ｈ＆Ｅ×１００）
2.3肠ＩＡＰ活性表达对照组与甘氨酸组肠组织ＩＡＰ表达呈强阳性，棕黑颗粒沉淀主要分布于细胞膜、微绒毛侧的胞浆内和微绒毛上。模型组２月、４月ＩＡＰ阳性反应逐渐减弱，表现为时间依赖性。甘氨酸干预可提高模型组ＩＡＰ表达。见图２。
2.4肠组织ＩＡＰ检测结果由表１可见，模型组肠组织ＩＡＰ在２月、４月表达明显低于对照组（P＜０．０１）。甘氨酸干预可明显提高模型组ＩＡＰ表达
3讨论
肠道不仅是机体消化、吸收的器官，在防止感
染方面也具有非常重要作用，这得益于肠黏膜屏障的存在。肠黏膜屏障由黏膜上皮细胞及其紧密连接和基膜组成。正常情况下由于肠黏膜屏障的存在，肠腔内细菌很难透过肠壁，肠黏膜仅吸收少量的ＬＰＳ，ＬＰＳ经门脉入肝脏大多被枯否细胞吞噬，很少进入血液循环。故ＩＥＴＭ的形成往往是由于肠道菌失调、肠壁通透性增高导致细菌移位增加及肝脏枯否细胞吞噬功能下降作用的结果。本研究模型组出现ＩＥＴＭ时，伴有肠黏膜屏障损伤也证实了上述观点。一旦ＩＥＴＭ形成，其可启动全身炎症性疾病的发生［5］。
动物实验研究表明，果糖饮食诱发大鼠发生多种代谢性疾病时伴有ＩＥＴＭ，ＩＥＴＭ通过炎症机制在代谢性疾病中发挥着重要作用［1，2］。Ｓｐｒｕｓｓ等［6］研究发现，长期高果糖饮食引起内毒素血症与肠道菌失调及肠黏膜屏障损伤密切相关。甘氨酸是机体的一种非必需氨基酸，研究发现，其对果糖饮食诱发的ＩＥＴＭ有明显改善作用［1］，但作用机制尚不清楚。本研究结果显示，果糖饮食致大鼠发生ＩＥＴＭ时，伴有肠黏膜屏障损伤、肠壁通透性增加；甘氨酸干预可减轻肠黏膜屏障损伤，改善ＩＥＴＭ。故可认为，甘氨酸对果糖饮食所致的肠黏膜屏障损伤可发挥保护作用，这可能是其改善ＩＥＴＭ的靶机制之一。
碱性磷酸酶（ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＡＰＫ）是一种含锌的糖蛋白，表达于哺乳动物体内，其活性是反应肝病及骨病的重要指标之一［7］。目前发现人体有４种基因编码表达不同的ＡＫＰ，分别为ＡＬＰ、肝－骨－肾型ＡＫＰ，胎盘型ＡＫＰ及胎盘样ＡＫＰ。其中，ＡＬＰ主
要表达于肠上皮细胞微绒毛顶端，仅有少量进入血液及肠腔。研究表明，ＡＬＰ在维持肠道内环境稳定及肠黏膜屏障结构完整中发挥着重要作用［3，4］。Ｇｏｌｄｂｅｒｇ等［3］研究发现，ＡＫＰ缺乏小鼠在缺
血再灌注后肠黏膜淋巴结细菌数量明显增加，且伴有肠黏膜屏障损伤。但甘氨酸改善ＩＥＴＭ的机制是否与ＡＫＰ有关，尚未见到相关研究报道。本研究结果显示，果糖饮食致大鼠发生ＩＥＴＭ时，伴有肠组织ＡＬＰ表达减少，且表现为时间依赖性；甘氨酸干预可促进肠组织ＡＬＰ表达，改善肠黏膜屏障损伤；血浆ＬＰＳ水平与肠ＡＬＰ表达负相关。故有理由相信，肠组织ＡＬＰ表达减少致肠黏膜屏障损伤是发生ＩＥＴＭ的原因之一，也是甘氨酸发挥保护作用的靶机制之一。
综上所述，果糖饮食致大鼠肠黏膜屏障损伤、肠壁通透性增加可能是形成ＩＥＴＭ的原因之一。甘氨酸通过促进肠组织ＡＬＰ表达，减轻肠黏膜屏障损伤对果糖饮食诱导的ＩＥＴＭ可发挥明显保护作用。
参考文献
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收稿日期：２０１４－０３－０８
注：Ａ：对照组，Ｂ：模型组２月，Ｃ：模型组４月，Ｄ：干预组２月，Ｅ：干预组４月。
图2不同组大鼠肠ＩＡＰ表达变化（Ｇｏｍｏｒｉ×１００）
（P ＜０．０５
）。对照组与甘氨酸组相比，肠组织ＩＡＰ水平变化差异无统计学意义（P ＞０．０５）。 2.5ＬＰＳ与ＩＡＰ的相关性各组血浆ＬＰＳ与肠组织
ＩＡＰ水平负相关（r s ＝０．６６，P ＜０．０５）。
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