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超高效液相谱-串联质谱法测定鸡蛋中氟喹诺酮类药物
张梦雪1，刘松雁1，王志恒1，高庆辉1，刘冰1，张琼2
(1.石家庄市畜产品质量监测中心050000;2.石家庄市动物卫生监督所050000)
摘要：目的建立鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留测定的液相谱-串联质谱检测方法。方法样品准确称量后加入1%乙酸乙腈，涡旋提取，冷冻离心，加入正己烷冷冻离心，过C18固相萃取柱，采用液相谱-串联质谱法检测鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留，采用空白基质加标法配制标准曲线，使用同位素内标法定量。结果4种氟喹诺酮类药物残留分离较好，线性范围为1~50μg/L ，回收率为80.15%~108.55%，相对标准偏差在(n=6)小于6.10%。结论该方法简单、快速、准确，可以满足检测需求，适合测定鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留测定。
关键词：鸡蛋；氟喹诺酮类；液相谱-串联质谱法蒽诺沙星(Enrofloxacin)、环丙沙星(Ciprofloxacin )、沙拉沙星(Sarafloxacin )、达氟沙星(Danofloxacin )均属于氟喹诺酮类药物，自1962年氟喹诺酮类药物问世，氟喹诺酮类药物因抗菌效果好，应用范围广，被广泛应用于动物生产中的疾病防治。但由于氟喹诺
酮类药物会在动物产品中残留蓄积，若在动物疾病防治过程中药物使用不当或者过量，会导致动物产品中残留过量，人食用后会造成对该药物的耐药，影响日后疾病的效果，长期食用还可能造成肝脏、关节损伤及致癌等后果，所以氟喹诺酮类药物残留问题引起了人们的关注。我国允许蒽诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、达氟沙星兽用，但规定了最高残留限量。本方法根据日常工作需求，建立了4种氟喹诺酮类药物：蒽诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、达氟沙星的液相谱-串联质谱法。
1材料与方法1.1仪器
液相谱-串联质谱仪(AB,Sciex 5500,ESI )、酸度计(梅特勒,S210)，电子天平(上海津平,YP202,d=0.01g )、电子天平(sarto ⁃rius,CP225D,d=0.1mg )，涡旋混合器(IKA,MS3digital )、多道涡旋混匀仪(heidolph )、冷冻离心机(ROTINA 公司,380R )、氮吹浓缩仪(Horizon technology )、固相萃取仪(PRESSURIZED SPE MANI ⁃FOLD )、冰箱(美菱)。
1.2耗材、试剂及标准品
固相萃取小柱为Agela Cleanert S C18(100mg/3mL )，水为一级水，甲醇、乙腈、正己烷、甲酸、乙酸均为谱纯，氢氧化钠、磷酸二氢钾为分析纯。标准品为蒽诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、达7.1孔雀石绿的添加的目
孔雀石绿其实不含有孔雀石的成分，只是两者颜相似而已。它是人工合成的三苯甲烷类有机化合物，有毒，主要用于铜的提炼和供作颜料。孔雀石绿针对鱼体水霉病和鱼卵的水霉病有特效，市面上还暂时没有针对水霉病且能短时间解决的特效药物，这也是为什么孔雀石绿在水产业多年禁而不止，水产业从业者铤而走险继续违规添加使用的根本原因，同时它还能很好的用于鳃霉病、小瓜虫病、车轮虫病、指环虫病、斜管虫病、三代虫病和其他细菌性疾病，都有很好的效果。我国将孔雀石绿列为食用动物禁用药物，非食用的观赏鱼还可使用。
7.2孔雀石绿的残留危害
研究发现，孔雀石绿进入水生动物体内后，经过快速代谢生成脂溶性的无孔雀石绿，其毒害性更高。孔雀石绿毒性较高且残留率高，还有较高的致癌、致畸和致突变潜在风险，在人体中的残留长时间积蓄式的危害健康。有的人虽然摄入量不多，不会有明显的中毒症状，但当体内孔雀石绿积蓄到一定程度，就可能引发各种疾病。
7.3孔雀石绿的检测
仝卓家境孔雀石绿及其在动物体内的代谢产物无孔雀石绿严重危害健康，人体几乎无法将其代谢出体外。在水产品中孔雀石绿的残留检测中，通常选择孔雀石绿及无孔雀石绿的总量为目标测定物质，检测方法主要包括高效液相谱法、液相谱-质谱联用法等仪器分析测定法；酶联免疫法、胶体金检测法等
免疫学检测方法和荧光定量检测法等。其中高效液相谱-串联质谱法为检测孔雀石绿残留的确证方法[9]。
针对动物源性食品中的非法添加物的检测，采用科学有效的抽样方法和更适合、更有针对性的检测方法非常关键，而如何辨别非法添加物的种类，有效识别非法添加物的性质才是目前
研究的重点和方向。
目前动物源性食品中已知的非法添加物还有很多，本文限于篇幅不能一一列举详细论述，只是列出在畜产品质量安全监管中重点监测的几种违禁添加物，简要论述其添加的目的、危害和常见检测方法，旨在抛砖引玉，引发更多的思考和研究，针对已出现的非法添加物研究更高效、简便、准确的检测方法，面对未知的有害添加物保持警惕和探索精神。用现代科学技术保障畜产品安全是我们长期的课题和任务。
参考文献
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[9]李斌，梁科.水产品中孔雀石绿残留快速检测技术的现状与突破.[J ].食品安全导刊,2019(9):27-29.
作者简介：张梦雪(1990-)，兽医师，主要从事畜产品质量安全检测工作
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氟沙星混合储备液，内标为蒽诺沙星D5，均为First Standard 公司储备液，浓度为100mg/L 。
1.3标准溶液的配制
精确移取适量标准储备液及内标储备液，用甲醇分别溶解为1mg/L 中间液；精确移取适量标准中间液及内标中间液，用空白基质分别溶解为1μg/L 、2μg/L 、5μg/L 、20μg/L 、50μg/L 的上机标准溶液。
1.4试液的配制
1%乙酸乙腈:5mL 乙酸，用乙腈稀释至500mL ;10mol/L 氢氧化钠溶液:20g 氢氧化钠，溶于50mL 水；磷酸盐缓冲液:6.8g 磷酸二氢钾，定容至500mL 水，用氢氧化钠溶液调节pH 至7.0±0.05;0.1%甲酸乙腈/水溶液:0.1mL 甲酸，用乙腈/水(体积,3/7)稀释至100mL 。
1.5样品的提取与净化
1.5.1提取准确称取
2.0g 均质的鸡蛋置于50mL 离心管中，加入适量内标中间液，涡旋混匀，加入20mL1%乙酸乙腈，混
匀3min ，置于冰箱中冷藏10min ，冷冻离心(4℃,10000r/m ,5min )，转移上清液。在上清液中加入20mL 正己烷，冷冻离心(4℃,10000r/m ,5min )，离心后不要取出，低温静置5min ，取出下层乙腈，氮气吹干(40℃水浴)。2mL 磷酸盐缓冲液复溶。
1.5.2净化C18固相萃取小柱，用3mL 乙腈、3mL 磷酸盐活化，样品溶液全部过柱，自然流速。在加1mL 磷酸盐缓冲液清洗试管，过柱。3mL 水淋洗，抽干。准确吸取1mL 0.1%甲酸乙腈/水溶液洗脱，抽干，洗脱液过0.22μm 滤膜，上机。
1.6检测条件
谱柱:Phenomenex Kinetex 2.6μm F5100  3.0×50mm 流动相:A 相0.1%甲酸水溶液,B 相0.1%甲酸乙腈流速:0.4mL/min 柱温：室温进样体积:10μL 梯度洗脱程序见下表1:
离子源及扫描方式：电喷雾离子源(ESI+)，多反应离子监测(MRM )
离子源温度:600℃离子源喷雾电压:5500V 气帘气:30psi 雾化气:50psi 干燥气:60psi 质谱条件见下表2:
流光飞舞歌词2结果与分析2.1实验结果
直来直往2.1.1谱分离良好
按照上述方法进行实验，对标准溶液及添加标准品的阳性添加样品进行测定，可得到谱图如下图1，各化合物分离良好:
2.1.2校正曲线与相关系数
测定1μg/L 、2μg/L 、5μg/L 、20μg/L 、50μg/L 的上机标准溶液，可得到线性方程及相关系数如表3。可得出4种氟喹诺酮类的浓度在1~50mg/mL 线性良好，相关系数大于0.99。
2.1.3回收率及相对标准偏差
在样品中，添加适量标准品，制成10μg/kg 的阳性添加样品，按照上述方法进行检测，可得到回收率为80.15%~108.55%，相对标准偏差在(n=6)小于6.10%。
2.2分析讨论
2.2.1经过多次试验证明，鸡蛋中的脂肪会对固相萃取小柱的通过性及回收率产生较大影响，所以在采取冷冻离心外，将样品置于低温下冷藏，并在加入正己烷除脂冷冻离心后，依旧在冷冻离心机中静置，有利于脂肪层分离、除脂，提高小柱的通过性及提高回收率。
2.2.2通过实验验证，达氟沙星的离子丰度比受基质效应影响较大，不能和标准品校正，故使用空白基质配置标准曲线溶液，离子丰度比可以对应。故采用空白基质加标法，消除基质效应。
3结论
本实验建立了鸡蛋中蒽诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、达氟沙星的液相谱-串联质谱法，该方法简单、快速、准确，回收率稳定，重现性好，可以满足检测需求，适合测定鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留测定。
参考文献
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高明骏2016,39(1):53-59.
葫芦娃主题曲简谱
表14
种氟喹诺酮类梯度洗脱程序
表24种氟喹诺酮类质谱条件
图14
种氟喹诺酮类质谱图
表34种氟喹诺酮类线性方程及相关系数
表44种氟喹诺酮类阳性添加回收率及相对标准偏差(n=6
anh khong doi qua)