猪的血清学试验：对结果的解释
Porcine serology: Interpreting the Results 作者：Carlos Artigas博士 (西班牙Hipra研究室兽医技术服务主任) 译者：秦崇德(上海市农业科学院畜牧兽医研究所)
正处在新世纪之初的当今，信息是我们在所有领域取得进展的最有价值的工具。正是由于这个原因，我们必须从一开始就将血清学分析作为从猪体和猪场取得信息的一个途径。 临床兽医每天并且以后仍将越来越多地在所有与健康和生产率有关的领域内利用血清学分析。在养猪生产中，对于血清学实验室得出的结果进行正确的分析，非常有助于我们得到为作出决策以及改进任何生产参数所需要的信息。
当今猪场的生产水平都非常高，这就使得猪场的疾病处于非常动态化的状况之中，尤其是当突然出现新的、容易引发其它疾病或本身就可引起免疫抑制的病毒性病原体的时候。由于这一动态状况，我们决不能忘记对猪场中所有可控制的参数进行控制的重要性，而这些参数中的一种就是猪的免疫状态。
对于猪来说，疾病就意味着生产率下降，疾病必须被看作是许多问题的集合，而不应被看作是单个的问题。血清学分析则是使这一问题集合得到解决所必需的工具。
血清学分析为我们提供了了解免疫学状态的机会，而我们可将所了解的信息用于： · 预防新的疾病进入猪场：新的疾病进入猪场，主要发生在引进新的后备母猪时；了解公猪中心的免疫状态，就可在采用人工授精时预防将新的疾病引入猪场； · 确定免疫接种的最佳时间：对于许多疾病来说，非常重要的就是要了解母源抗体水平的下降情况； · 了解猪的健康状况：定期进行血清学分析，就可对不同次取样的分析结果进行比较，从而了解猪的正常免疫状态(每个猪场的正常免疫状态都是互不同的)； · 进行疾病诊断：在猪场发生了某种疾病时，我们可进行血清学研究而将研究结果与该猪场的正常情况进行比较。发生感染之后，抗体水平通常会在15天内增高2～3倍，具体时间取决于疾病的种类； · 判断保护力水平的高低：在免疫接种之后，我们可根据血清学分析结果而得知血液中抗体水平是否达到了预期水平，这对于了解疾病来说也是非常重要的。在有些情况下，不是因为寂寞IgG的水平并不能代表保护力水平的高低。 要控制猪场的免疫学状态，是很容易的，费用也不高。说做起来容易，是因为兽医是经常对猪采血的，而且又有许多实验室能够进行高质量的血清学分析。血清学分析的成本非常低，采用ＥＬＩＳＡ技术，我们就可在很短的时间内完成多项测试。 为了能通过血清学分析得到优良的结果和信息，兽医和实验室必须以团队精神协同工作。 临床兽医在开始取样之前必须弄清一些基本问题： · 是哪些猪？ · 有多少猪？ · 如
何取样？ · 如何递送样品？ · 什么样的递送服务？ · 达芬奇的画布哪个实验室？ · 哪一类分析最好 一旦澄清了问题的答案，就可以在一切都得到完全控制的安全条件下开始采样。 另一方面，实验室必须保证他们所作的分析，从接收样品开始直到将结果送达兽医为止的整个过程，都以优良的质量得到完成。 实验室应该按照GLP或ISO的规则，确保分析结果的质量。实验室所遵循的所有标准确保实验室拥有合格的人员、标准而有效的实验设备、采用标准化的试剂、向兽医提供明白无误的结果。 兽医和实验室之间良好的协同工作，可使我们获得非常有价值的结果，其中包含着准确的信息，使我们能据以作出最佳的决策。 定 义 血清学试验：按Tizard的说法，血清学试验是研究如何检测血清中特异性抗体的科学。 血清：血清是血液在凝固过程中分离出来的液体。 血浆：血浆是血液的液体部分。 抗体：抗体是机体为抵抗入侵机体的外来病原体而产生的第二道防卫手段。抗体由蛋白质组成，其结构和编码决定了它可与特定的抗原起反应。抗体可因与新型外来病原体直接接触而产生 主动免疫力 ，也可通过吸吮母乳获得抗体而获得被动免疫力。 免疫学血清分析：研究抗体的动态水平，样品采集于不同的时间或在同一时间采集。 所有抗体检测技术的目的都是揭示感染后或免疫接种后产生的特定抗原／抗体复合体的量。血清学实验室采用的技术有许多不同的种类，例如快速玻片凝集试验、血凝抑制试验、补体结合试验、ELISA(酶联免疫吸附试
验)，等等。当今血清学实验室最常用的技术就是ELISA试验，因为采用这一技术能快速进行大量分析，并得到可靠而经济的结果。 在酶联免疫试验中，酶联免疫吸附试验利用标记的结合物(通常是过氧化物酶)使抗原/抗体反应可被肉眼所见。依情况的不同，总是存在一个抗原被结合的固相。最后，会发生变反应，对其可用ELISA阅读器对其度量从而进行定量，并且总是能对分析的血清进行定性。 ELISA技术有不同的类别，但一般来说，我们可将其分为以下几种：夹心ELISA、间接ELISA、和竞争性ELISA(表１)。
表1 酶联免疫吸附试验(ELISA)我好寂寞的种类 ELISA试验的种类 测定对象 性 质 夹心 抗原 定性 竞争性 抗体 定性 间接 抗体 定量
间接ELISA技术比较容易进行，可被用来测定抗体摘度；竞争性ELISA则被用来对阳性可阴性进行定性。 Levrier(1993)提出，采用间接ELISA技术可对兽医根据临床症状和病变作出的诊断进行进一步确诊，可用以进行鉴别诊断，可用以研究母源抗体的传递，不能用以测定保护力水平因为保护力并非总是与体液免疫力相关，无论对哪一种病毒都可作出准确诊断，由于有许多变量可影响结果所以必须对结果进行标准化。 在各种实验室技术中，我们需要的是可靠。一声所爱大地飞歌“可靠”一词的含义很多，在实验室技术中，其含义不是别的，而是指可
检出率、灵敏性、特异性、可重复性、可再现性和检测力。下文就详细介绍这些词汇。 可检出率：这是指这一技术检出少量抗体的能力，这一能力通常是指该技术能检测出的标准血清的稀释度。 灵敏度：这是指经检出的真阳性的比例（以一系列标准真阳性作为参照）。 特异性：这是指能检出的真阴性的比例（以一系列标准真阴性作为参照）。 可重复性/可再现性：对于一个试验来说，如果无论我们进行多少次，该试验都能得出相同或相近的结果，那就是说该试验的可重复性/可再现性很高。可重复性是指同一人在同一时刻用同样的平板进行试验可得出相同或相近的结果。 检测力：是指一种试验在试验条件有微小变化下的情况下提供相同结果的能力。 疾 病 生死依托片尾曲 表2列出了对若干疾病进行血清分析所用的传统血清学技术和当前所用的技术。
表2 对不同疾病进行血清学分析时所用的技术 疾病 传统血清学技术 当前所用技术 伪狂犬病 血清中和技术抗原 ELISA 细小病毒病 血凝抑制试验 ELISA 猪流感 血凝抑制 ELISA 猪繁殖和呼吸综合片 单层免疫氧化物酶试验(IPMA) ELISA 猪丹毒 生长凝集试验 ELISA 地方性肺炎 间接免疫荧炮试验 ELISA 胸膜肺炎 慢速血凝试验 ELISA
通常用传统技术来测定阳性和阴性之间和临界值水平；这就是说，如果用血清中和技术测
得伪狂犬病的血清阳性水平为大于或等于1/8，那么就以具有这一摘度的血清作为ELISA技术标准化的阳性参照。 同时还必须说明的是，用两种不同的技术来测定同一疾病的抗体时，所得的结果之间很难具有良好的相关。唯一可以预知的是，两种技术在阳性和阴性测定之间存在着良好的相关。但是，更加困难的是用一种技术测得很高的水平时用另一种技术也能测得同样高的水平，因为大多数我们想与之相关的技术测定的都不是同一种抗体。以猪繁殖和呼吸综合征为例，免疫过氧化物酶试验测得的水平与ELISA试验测得的水平之间相关性就很差，即使在测定一猪中的阳性和阴性时其间的相关性很好。 下文简述猪在接种不同的疫苗后或感染了，不同的微生物后的结果。我们不能说有一个特定的摘度，因为我们都知道，现时各实验定没有一个统一的结果判断标准。因而，非常重要的是，每一个临床兽医都必须准确了解实验室的可信度及其参照水平。 我们若要了解一直实行常规免疫程序的猪场的免疫状态，最好就要采用总抗体技术（间接ELISA）。要获得结果，就要在免疫接捉后3周时采样，因为这时是猪体内抗体水平最高的时候。在进行血清分析时很容易测定这一参数。 伪狂犬病 对于伪狂犬病，可用多种不同的技术测定其抗体。 我们可测定其血清中的总抗体或抗其特异性糖蛋白gE和gB的抗体。前者是猪接触田间野毒后产生的，后者是猪接触疫苗病毒后产生的。 我们若想了解猪场的免疫力状况，或想测定其血清my love song
阳转的情况，我们可采用总抗体技术，即间接ELISA 技术。但我们若想了解猪场内病毒的存在情况，我们则通常采用检测猪体内gE(+)的技术，即竞争ELISA技术。 感染 可在感染后7天时采用间接ELISAＡ技术或竞争性gE ELISA技术来测定血清阳转情况。 免疫接种 接种用的疫苗有活苗和灭活苗两种。 对血清阴性的猪接种活苗时，采用竞争性ELISA技术(gB)可在接种后10天时检测到血清阳转，采用间接ELISA技术则可在接种后12天时测得其血清阳转。 如果接种的是灭活苗，那么所有各种技术都可至迟在接种15天时测得其血清阳转。 对于多次接种的母猪，采用任何技术都可很容易地测得其抗体。 被动免疫力 这是为确定免疫接种最佳时间而必须了解的一个重要参数。 如果采用间接ELISA技术，对于多次免疫接种的母猪所产的仔猪来说，可在其8或9周龄时还能检测到其血清抗体。 细小病毒病 我们通常采用血凝抑制试验来测定抗细小病毒抗体，但如今许多实验室则采用ELISA术来报告结果，两种试验的结果之间有很好的相关性。采用血凝抑制技术时，以1/16以上的滴度为阳性。一般来说，血清抗体滴度等于或高于1/32时才认为具有保护力。 感染 感染后21天时，用血凝抑制技术可检测到明显的血清阳转。抗体滴度可增高３个对数值以上(比如，感染前抗体滴度为1/64，感染后就增高到了1/512)。这是因为细小病毒是猪场中通常存在的病毒之一；母猪只要经过免疫接种，那么生活在这样的环境中就不会发生问题。 在
新近感染了细小病毒的猪，常常可发现很高比例个体的抗体滴度达到1/4096。 最后，我们可在木乃伊流产发生之前很早就见到细小病毒抗体滴度增高，这就是说，详细地研究抗细小病毒抗体的消长情况，有助于我们在出现任何繁殖问题之前及时采取措施。 免疫接种 当前所用的所有疫苗都是灭活苗，有单价的，也有多价的。免疫接种后抗体的血凝抑制滴度相当低。 血清阴性猪在免疫接种21天后，用血凝抑制试验可检测到平均抗体滴度为1/32。 扩繁场的母猪通常在到达生产场时进行免疫接种，然后在21～42天时进行重复接种，如前所述抗体水平是非常低的。重复接种2个月后以及与猪场中其它母猪相接触2个月后，我们可以发现非常高的滴度，与感染后的滴度相同，这表明疫苗并不能阻止血清阳转但能阻止繁殖障碍。 猪流感 可以采用血凝抑制试验测定各种流感毒株的抗体，但当今可用间接ELISA技术测定抗Ａ型流感病毒的IgG水平。 感染 对于猪来说，感染后21天时很难表现出明显的血清阳转。这使得我们认为不能将血清学试验用于诊断。我们通常将猪流感血清学分析以回顾性的方式用以证实感染，这在不进行免疫接种的猪场是非常重要的。如果ELISA技术可测得异性抗体的平均滴度为临水平的两倍以上,我们就能确证流感病毒感染的存在。 在母猪场，也可以同样的标准来证实流感病毒感染，即使免疫接种使我们不得不承认存在正常的滴度水平，我们也能因此而确认没有正常个体存在。 免疫接种 当今所有
的疫苗都含两种常见的毒株H１Ｎ１和H3N2，至迟在免疫接种后3周时发生血清阳转，如果采用ELISA技术就可发现抗体。疫苗可产生很好的保护力和血清阳转。 被动免疫力 免疫母猪或感染了野毒的母猪所产的仔猪直到3～8周龄时，我们可用ELISA技术发现其抗体，但这时的抗体已不具有保护力了。正因为如此，我们建议，在感染风险很高的猪场，仔猪超过4周龄就应接受疫苗接种以便获得保护力从而避免受到感染。 猪丹毒 我们曾经用生长凝集试验(Gat)来测定猪丹毒抗体，但由于这一技术的操作难度较大，所以现在已代之以间接ELISA技术了。 大多数猪场的地面上都存在猪丹毒杆菌，所以未经免疫接种的猪以及从未表现临床症状的猪都具有高水平的特异性抗体。 感染 感染后10天时就可用间接ELISA技术测定到血清阳转。 抗体滴度高，表明了猪场是最近受到感染的。对猪场进行血清学分析，很容易证实该猪场出了问题。对于猪丹毒感染来说也就是这样的。 在没有进行过猪丹毒免疫接种的猪场，以及在发现70%母猪血清阳性的猪场，都可开始发生猪丹毒。 我们发现有些送到屠宰厂的肥育猪具有很高的猪丹毒特异性抗体，这表明这些猪曾在肥育期间接触了猪丹毒杆菌。 免疫接种 用于抗猪丹毒的疫苗，通常都能产生很高的抗体滴度，因而对急性病例和慢性病例都有保护作用。 疫苗只能保护母猪而不能保护仔猪。 对于一些将在非常大龄时送去屠宰的肥育猪必须进行免疫接种，这些猪会表现非常高的抗体水平。
被动免疫力 经多次免疫接种的母猪所产的仔猪直到12～14周龄时还可检测到其体内具有抗体，但这时的抗体水平已不足以保护其抵抗感染。 猪繁殖和呼吸综合征 通常总是用单层免疫过氧化物酶技术进行血清学分析，该技术通常利用单克隆抗体，但常规实验室现在采用的是ELISA试验。 感染 感染后7天就可测定到抗体水平增高，但并非能在所有的个体都检测得到。感染后21天时100%的个体都成为血清阳性。 免疫接种 灭活苗和活苗都是常用的。 灭活苗可诱导较低的IgG(体液免疫力)水平，所以在免疫接种后用常规技术检测到较低的抗体水平。 活苗可诱导较高的IgG(体液免疫力)水平，并能刺激细胞免疫应答(细胞免疫力)。 若应用活苗，可在接种后7天检测到抗体应答，接种后21天时100%的猪成为血清阳性。 被动免疫力 血清阳性的母猪所产的仔猪直到6或7周龄时血液中还存在可检测到的抗体水平。 在非稳定化猪场，通常100%的仔猪都在7～10周龄时成为血清阳性。 猪地方性肺炎 对于此病所用的传统检测技术是荧光抗体技术，但常规实验室现在所用的是竞争ELISA技术。该技术利用抗特异性蛋白质p74的单克隆抗体进行检测。 感染 这种感染的血清学应答发生得非常迟。 感染后7或8周时才能检测到抗体，此后通常100%的猪都会成为血清阳性。 免疫接种 接种后21天时可检测到抗体应答，重复接种后抗体水平很高。 对仔猪接种时必须注意其被动免疫力。 被动免疫力 被动免疫力取决于猪的免疫状态。在感染
压很大的猪场，可在８周龄时检测到抗体。 猪胸摸肺炎 过去所用的传统检测技术是慢速凝集试验(SAT)，但该技术对于不同血清型的特异性不高。 如今我们采用ELISA技术，该技术可用于检测具有交叉反应性问题的不同血清型；或者，在任何情况下，我们都可采用利用重组蛋白质(ApX I和Tbp2)的特异性ELISA技术。 感染 对于现场感染，可在感染后3周时检测到抗体应答。7～12周龄是仔猪容易受感染的时候。 免疫接种 接种通常菌苗后3周时可检测到相当水平的抗体。 采用重组疫苗不能产生可检测到的抗体应答。 被动免疫力 血清阳性母猪所产的仔猪，直到6或8周龄时血液中还存在可检测到的抗体。这些抗体具有保护力，所以幼猪不会受到胸膜肺炎放线杆菌的感染。 结 语 ·血清学分析不一定能用作诊断方法，血清学分析可提供重要信息。 ·对结果的解释是最重要的，并且必须针对全进行考虑。 总而言之，我们想以这样一句话来结束我们的文章：“清学分析对于改善猪健康从而提高猪生产率来说是必不可少的”
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