㊃671㊃中国真菌学杂志2021年6月第16卷第3期 C h i n J M y c o l,J u n e2021,V o l16,N o.3
㊃论著㊃中药小檗碱协同抗真菌药对马尔尼菲篮状菌的体外药敏试验研究
张馨予1潘开素2罗宏2郑冬燕1郑艳青2曹存巍1梁纲3
(1.广西医科大学第一附属医院皮肤性病科，南宁530021;2.广西艾滋病防治研究重点实验室，南宁530021;3.广西医科大学基础医学院，南宁530022)
ʌ摘要ɔ目的探讨小檗碱单独及与常规抗真菌药物联合使用后对马尔尼菲篮状菌酵母相的作用效果㊂方法采用C L S I 棋盘法对21株马尔尼菲篮状菌(T a l a r o m y c e s m a r n e f f e i,TM)进行体外药敏试验，使用分数抑制浓度指数(F I C I)判断药物相互作用:F I C Iɤ0.5为协同作用,F I C I>4为拮抗作用,0.5<F I C Iɤ4为无关作用㊂利用时间-杀菌曲线进一步确认相互作用㊂结果小檗碱联合常用抗真菌药物具有协同作用，协同作用率分别为：小檗碱/氟康唑(47.62%)，小檗碱/伊曲康唑(66.67%)，小檗碱/伏立康唑(71.43%)，小檗碱/两性霉素B(71.43%)，小檗碱/卡泊芬净(52.38%)㊂时间-杀菌实验结果显示,5组联合用药组在24h时每毫升TM的C F U的对数值均与任意单用药物组相比下降大于等于2个单位㊂所有组合均未观察到拮抗作用㊂结论中药小檗碱体外对马尔尼菲篮状菌具有抑制作用，与常规抗真菌药联合使用可大大降低抗真菌药物对马尔尼菲篮状菌酵母相的M I C值㊂这结论为小檗碱联合抗真菌药应用于马尔尼菲篮状菌病的提供实验室基础㊂
ʌ关键词ɔ马尔尼菲篮状菌；小檗碱；药敏试验；联合
ʌ中图分类号ɔ R379.9 R978.5ʌ文献标志码ɔ A ʌ文章编号ɔ1673-3827(2021)16-0176-06
I n v i t r o s u s c e p t i b i l i t y o f b e r b e r i n e c o m b i n e d w i t h a n t i f u n g a l a g e n t s a g a i n s t T a l a r o m y c e s m a r n e f f e i
Z HA N G X i n y u1,P A N K a i s u2,L U O H o n g2,Z H E N G D o n g y a n1,Z H E N G Y a n q i n2,C A O C u n w e i1,L I A N G G a n g3 (1.D e p a r t m e n t o f D e r m a t o l o g y a n d V e n e r e o l o g y,T h e F i r s t A f f i l i a t e d h o s p i t a l o f G u a n g x i M e d i c a l U n i v e r s i t y,N a n-n i n g530021,C h i n a;2.G u a n g x i K e y L a b o r a t o r y o f A I D S P r e v e n t i o n a n d T r e a t m e n t,N a n n i n g530021,C h i n a;
3.G u a n g x i M e d i c a l U n i v e r s i t y,S c h o o l o f B a s i c M e d i c i n e S c i e n c e s,N a n n i n g530021,C h i n a)
ʌA b s t r a c tɔO b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t o f b e r b e r i n e a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n w i t h c o n v e n t i o n a l a n t i f u n g a l d r u g s o n T a l a r o m y c e s m a r n e f f e i y e a s t.M e t h o d s T w e n t y-o n e i s o l a t e s o f T.m a r n e f f e i w e r e a s s a y e d.D r u g i
n t e r a c t i o n s w e r e a s-s e s s e d w i t h t h e c h e q u e r b o a r d t e c h n i q u e u s i n g t h e C L S I m i c r o d i l u t i o n m e t h o d(M27-A3)w i t h m i n o r m o d i f i c a t i o n s.T h e f r a c-t i o n a l i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n i n d e x(F I C I)w a s u s e d t o c l a s s i f y d r u g i n t e r a c t i o n s.T i m e-k i l l c u r v e s w e r e u s e d t o c o n f i r m t h e s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n.R e s u l t s B e r b e r i n e/v o r i c o n a z o l e a n d b e r b e r i n e/a m p h o t e r i c i n B c o m b i n a t i o n s h o w e d t h e h i g h e s t p e r-c e n t a g e o f s y n e r g i c i n t e r a c t i o n(71.4%);f o l l o w e d b y b e r b e r i n e/i t r a c o n a z o l e(66.67%),b e r b e r i n e/f l u c o n a z o l e(47.62%), b e r b e r i n e/c a s p o f u n g i n(52.38%),r e s p e c t i v e l y.T i m e-k i l l c u r v e s c o n f i r m e d t h e s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n,n o a n t a g o n i s t i c o r i n-d i f f e r e n t a c t i o n w a s o b s e r v e d.C o n c l u s i o n s I n v i t r o b e r b e r i n e c o u l d e n h a n c e s t h e e f f i c a c y o f a n t i f u n g a l a g e n t s a g a i n s t t h e y e a s t f o r m o f T.m a r n e f f e i.T h e M I C v a l u e c a n b e g r e a t l y r e d u c e d w h e n c o m b i n e d w i t h c o n v e n t i o n a l a n t i f u n g a l d r u g s.T h e r e s u l t s i n d i c a t e d b e r b e r i n e m i g h t h a v e a p o t e n t i a l r o l e i n c o m b i n a t i o n w i t h a n t i f u n g a l a g e n t s i n f r e a t i n g p a t i e n t s i n f e c t e d w i t h T.m a r n e f f e i.
ʌK e y w o r d sɔT a l a r o m y c e s m a r n e f f e i;b e r b e r i n e;a n t i f u n g a l s u s c e p t i b i l i t y;c o m b i n e d t h e r a p y
[C h i n J M y c o l,2021,16(3):176-181]
作者简介：张馨予，女(回族)，博士研究生在读，医师.E-m a i l:z h a n g x i n y u g x@163.c o m
通信作者：梁纲,E-m a i l:l i a n g g9507-c n@s i n a.c o m
马尔尼菲篮状菌(T a l a r o m y c e s m a r n e f f e i, T M)是温度依赖性的双相真菌，在东南亚如泰国㊁越南以及我国的广西㊁广东等地区流行，可引起免疫缺陷患者，特别是艾滋病患者的系统播散性感染[1]㊂至今为止单一抗真菌药物马尔尼菲篮状菌病(T S M)的疗效不佳，而两性霉素B仍是的首选药物，但两性霉素B在临床应用过程中极易出现肝肾毒性㊁顽固性低钾㊁骨髓抑制等不良反应，导致部分患者因不能耐受而放弃[2]㊂因此，寻用药剂量小㊁不良反应少㊁疗效佳㊁费用低的方案迫在眉睫[3-4]㊂随着对传统中药的深入研究，既往发现蛇床子素对T M酵母相有较强的抑制活性，氟康唑天然耐药株以及两性霉素B耐药株也对蛇床子素敏感[5]㊂传统中药小檗碱是从黄连㊁黄柏等植物中提取的生物碱，具有显著的抗菌疗效，用来细菌性胃肠炎㊁痢疾等疾病已有很长的历史[5-6]㊂近年来，小檗碱的其他药理作用逐渐被发现，有研究表明在白念珠菌和隐球菌的中，小檗碱无论是单独使用还是与其他抗真菌药物合用，都有显著的疗效[7-8]㊂然而，目前尚无小檗碱单独使用或联合其他抗真菌药物T S M的研究报道㊂在本研究中，我们使用小檗碱联合氟康唑㊁伊曲康唑㊁伏立康唑㊁两性霉素B㊁卡泊芬净对21株T M酵母相进行体外药敏试验研究，观察其作用效果，为小檗碱应用于马尔尼菲篮状菌病的提供实验室依据㊂
1材料与方法
1.1菌株
选取广西医科大学第一附属医院皮肤性病科存储的21株TM㊂其中10株分离自临床患者，编号为C I-1~10;10株分离自竹鼠，编号为B r I-1~ 10㊂T M标准株为F R R2161(w i l d t y p e,WT)，由墨尔本大学A l e x A n d r o n o p o l u s教授惠赠㊂药敏实验质控株为近平滑念珠菌A T C C22019，由北京大学真菌研究中心惠赠㊂
1.2菌悬液的制备
实验前所有受试菌均接种在脑心磷脂葡萄糖培养基(B H I)上37ħ培养，每7d传代1次，共传3代，直至95%以上的细胞为酵母细胞㊂酵母细胞收集方法如前期文献所述[3]，用比浊仪调整菌悬液浓度至(1~5)ˑ106c e l l/m L，再用R P M I1640液体培养基稀释1000倍，得到(1~5)ˑ103c e l l/m L 的4倍终浓度的接种菌悬液㊂
1.3抗真菌药物
本研究中使用的药物包括：氟康唑(F L C)㊁伊曲康唑(I T C)㊁伏立康唑(V O C)，两性霉素B (A m B)㊁卡泊芬净(C A S)和小檗碱(B B R)，均购自美国s i g m a公司，纯粉末制剂㊂A m B㊁I T C㊁V O C 和B
B R在100%二甲基亚砜(D M S O)中溶解并配成12800μg/m L的储存液㊂C A S和F L C使用灭菌水溶解配制成16000μg/m L的储存液㊂实验前用R P M I1640液体培养基将药物稀释成4倍终浓度工作液㊂
1.4抗真菌药敏试验
参照美国临床实验室标准研究所(C L S I)颁布的酵母菌抗真菌药物敏感性试验方案M27-A3并稍作修改㊂药敏板药物浓度:F L C为1~128μg/ m L,I T C和V O C为0.00078~1μg/m L,A m B为0.0625~8μg/m L,C A S为0.5~64μg/m L,B B R 为4~512μg/m L㊂96孔板的第1~8列为联合药物(每种药物加入50μL)，例如小檗碱/氟康唑组合时，从左到右第一个孔为最高浓度1024μg/m L 的B B R50μL，第二孔512μg/m L的50μL，浓度依次倍比降低，直到第8孔为8μg/m L的50μL；同理，从第1排A孔加入F L C256μg/m L的50μL，浓度倍比降低直至F孔为2μg/m L的50μL㊂第9㊁10列为单药(每种药物加入100μL)，第11列为阴性对照(加入200μL R P M I1640液体)，第12列加入200μL菌悬液作为阳性对照㊂37ħ下培养48h观察结果，每株实验菌株均在不同时间重复3次实验，结果取中位数㊂每次实验均使用近平滑念珠菌A T C C22019进行质控㊂用视觉法判定终点，与生长对照孔相比ȡ50%生长抑制所对应的最低药物浓度为F L C㊁V O C㊁I T C及C A S的M I C值;
B B R和A m B的M I C定义为100%生长抑制所对应的最低药物浓度㊂分数抑制浓度指数(F I
C I)用于药物相互作用的分类,F I C I=M I C(A联合)/(A 单药)+M I C(B联合)/(B单药)㊂F I C Iɤ0.5表示协同
作用,F I C I>4为拮抗作用,0.5<F I C Iɤ4为无关作用㊂
1.5时间-杀伤曲线
参照文献，用R P M I1640培养基制备标准株F R R2161菌悬液浓度105C F U/m L[9]㊂实验分为生长对照组㊁小檗碱单用组㊁氟康唑单用组以及小檗碱与氟康唑联用组㊂同样伊曲康唑㊁伏立康唑㊁
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两性霉素B㊁卡泊芬净分别单独应用或者与小檗碱联用，各组总体积均为4m L㊂每组加入1m L菌液和1m L的药液，生长对照组仅加入1m L菌液，不足4m L体系的用R P M I1640补足，使其终浓度分别对应药物M I C值的1/4，即B B R8μg/m L㊁
F L C0.5μg/m L㊁I T C和V O C0.015μg/m L㊁A m B
0.25μg/m L㊁C A S4μg/m L，总容积中D M S O体积<1%㊂
将菌悬液与药混匀后，置于37ħ摇床孵育，在0h㊁12h㊁24h㊁36h和48h时间点，从每种溶液中取出100
μL混合液，并在无菌水中稀释10倍㊂取100μL在沙堡弱葡萄糖琼脂平板上接种,37ħ孵育48h后测定菌落计数㊂实验重复3次，取3次结果的平均值㊂24h后，当联合用药组每毫升T M 的C F U的对数值与任意单用药物组相比下降大于等于2个单位，即ȡ2.0l o g10C F U/m L，则认为两药有协同作用或拮抗作用㊂若改变<2.0 l o g10C F U/m L则为无关作用[8]㊂
2结果
对21株TM的体外药敏试验结果见表1㊁2㊁3㊂药物单独使用时,B B R对T M的M I C值在32 ~64μg/m L之间，其他药物单独用药对T M的M I C值与既往的研究结果相似[3,4,10]㊂当B B R与其他5种药物联合用药时均可以观察到协同作用㊂最强的协同作用在B B R/V O C㊁B B R/A m B这两种组合(两种组合对21株菌作用后，均有15株菌表现为协同作用，协同作用率为71.43%)，其次是B B R/I T C(66.67%)㊁B B R/F L C(52.38%)和B B R/C A S(52.38%)㊂药物联合作用后,M I C值均显著降低，即F L C由64μg/m L下降至4μg/m L (64ң4μg/m L)，同理V O C(0.125ң0.015μg/ m L),I T C(0.125ң0.015μg/m L),A m B(2ң0.25μg/m L),C A S(32ң2μg/m L)㊂另外，在任何联合用药中均未发现有拮抗现象,F I C I的几何均数均较低，最高仅为0.53(B B R/F L C组合)㊂
时间-杀菌实验也证实了5种联合用药之间的协同作用:B B R与F L C联用,24h后每毫升TM 的C F U的对数值与任意单用药物组相比下降2.3l o g10C F U/m L；小檗碱与I T C㊁V O C㊁A m B联用24h后均下降
了2.0l o g10C F U/m L(见图1)㊂表1药物单独作用于21株马尔尼菲篮状菌酵母相的体外药敏试验(μg/m L)
T a b.1S u s c e p t i b i l i t i e s o f t e s t e d d r u g s a l o n e a g a i n s t21i s o l a t e s o f y e a s t f o r m o f T.m a r n e f f e i(μg/m L)
药物a M I C范围GM M I C M I C90M I C50 F L C2~643.3942
I T C0.06~0.250.100.1250.125 V O C0.06~0.1250.080.1250.06 A m B1~21.7522
C A S16~3223.783232 B B R32~6441.676432 GM：几何均数㊂
a F L C，氟康唑;I T C，伊曲康唑;V O C，伏立康唑;A m B，两性霉素B;
C A S，卡泊芬净;B B R，小檗碱㊂
M I C90：测得的M I C值从低往高进行累积分布，累积分布率ȡ90%时的最小M I C浓度值㊂
M I C50：测得的M I C值从低往高进行累积分布，累积分布率ȡ50%时的最小M I C浓度值㊂
表2小檗碱分别与不同药物联合使用对马尔尼菲篮状菌酵母相的体外药敏实验结果T a b.2 M I C s o f d r
u g c o m b i n a t i o n,F I C I r a n g e s,a n d r a t i o s o f s t r a i n s f o r w h i c h t h e d r u g c o m b i n a t i o n s s h o w e d s y n e r g y
药物组合M I C s范围(μg/m L)F I C I c范围GM F I C I协同作用率(%)*
B B R-F L C(8~32)-(0.5~8)0.25~0.750.5347.62
B B R-I T C(4~8)-(0.015~0.06)0.245~0.750.4466.67
B B R-V O C(4~16)-(0.015~0.03)0.303~0.750.4971.43
B B R-A m B(8~16)-(0.25~1)0.25~0.750.4771.43
B B R-
C A S(8~16)-(2~8)0.25~1.00.4952.38
c F I C I：分数抑制浓度指数(协同作用,F I C Iɤ0.5；无关作用,0.5<F I C Iɤ4拮抗作用,F I C I>4.0)㊂
*药物联合作用后出现协同作用的菌株百分比㊂
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表3 小檗碱与氟康唑㊁伊曲康唑㊁伏立康唑㊁两性霉素B 及卡泊芬净联合对马尔尼菲篮状菌酵母相的体外药敏试验
T a b .3 I n v i t r o i n t e r a c t i o n s o f b e r b e r i n e w i t h f l u c o n a z o l e ,i t r a c o n a z o l e ,v o r i c o n a z o l e ,a m p h o t e r i c i n B ,a n d c a s p o f u n g i n a g
a i n s t t h e p a t h o -g e n i c y e a s t f o r m o f T .m a r n e f f
e i 菌株M I C (μ
g /m L )B B R F L C B B R /F L C F I C I M I C (μ
g /m L )I T C
B B R /I T
C F I C I M I C (μ
g /m L )V O C
B B R /V O
C F I C I WT
#3228/0.50.5
0.1254/0.030.3650.1258/0.03
0.49C I -1
d
3228/1
0.750.25
4/0.030.2450.068/0.0150.5C I -26448/0.50.250.1258/0.030.3650.06
16/0.015
0.5
C I -33228/10.750.1254/0.06
0.6050.1258/0.030.49C I -43228/0.50.5
遇到王蓝茵0.068/0.0150.5
0.1258/0.030.49C I -53228/10.750.1258/0.030.490.06
16/0.015
0.75C I -63228/10.750.1254/0.060.6050.1258/0.030.49
C I -76448/0.50.250.1258/0.030.3650.068/0.030.625C I -8324
16/10.750.068/0.030.75
0.064/0.030.625C I -9
326416/80.6250.064/0.0150.3750.068/0.0150.5C I -10646416/40.31250.1258/0.060.6050.0616/0.030.75B r I -1
e
6428/10.6250.1254/0.030.30250.068/0.030.625B r I -26428/1
0.6250.06
8/0.015
0.3750.0616/0.0150.5B r I -33228/0.50.50.1254/0.030.3650.1254/0.0150.245B r I -43248/0.50.3750.1254/0.030.3650.068/0.0150.5B r I -53228/0.5
0.50.1254/0.030.3650.1258/0.0150.37
B r I -664232/0.50.750.068/0.030.6250.1254/0.030.3025B r I -764416/10.50.064/0.030.56250.068/0.0150.375B r I -83228/10.750.1254/0.030.3650.1254/0.030.365B r I -9
3248/0.50.3750.1258/0.030.490.068/0.0150.5
B r I -10
64
28/10.6250.06
8/0.030.6250.068/0.030.625菌株M I C (μ
g /m L )B B R A m B B B R /A m B F I C I M I C (μ
g /m L )C A S B B R /C A S F I C I WT
3228/0.5
0.5
1616/81C I -132216/0.50.753216/40.625C I -26428/0.50.375328/40.25
C I -332216/0.250.625168/20.375C I -432116/0.250.751616/2
0.625C I -53228/0.50.5168/40.5C I -63228/0.50.5328/2
0.3125C I -76428/0.250.25
3216/20.3125C I -83218/0.250.53216/40.625C I -9
3228/0.5
0.5
1616/20.625C I -106428/0.250.251616/20.375B r I -16428/0.250.25
3216/20.3125B r I -26428/0.50.3751616/40.5B r I -332
2
8/10.751616/4
0.75㊃
971㊃ 中国真菌学杂志2021年6月第16卷第3期 C h i n J M y
c o l ,J u n e 2021,V o l 16,N o .3
(续表)
菌株M I C (μ
g /m L )B B R A m B B B R /A m B F I C I M I C (μ
g /m L )C A S B B R /C A S F I C I B r I -43228/0.250.375168/8
0.75B r I -53228/0.5
0.51616/40.75
B r I -664216/0.50.5
1616/20.375B r I -76428/0.50.3751616/80.75B r I -83218/0.50.75168/20.375B r I -9
32116/0.25
0.75
3216/40.625B r I -10
64
2
8/0.5
0.375
16
16/20.375#
WT :w i d e t y p
e ，野生株;d C I :c l i n i c a l i s o l a t e s ，临床菌株;e
B r I :b a m b o o r a t s i s o l a t e s ，竹鼠分离株
㊂图1 小檗碱联合氟康唑㊁伊曲康唑㊁伏立康唑㊁两性霉素B 及卡泊芬净对F R R 2161的时间-
杀伤曲线F i g
.1 T i m e -k i l l c u r v e s o f T .m a r n e f f e i t y p e s t r a i n F R R 2161t h a t w e r e o b t a i n e d b y u s i n g B B R c o m b i n e d w i t h F L C ,I T C ,V O C ,AM B ,K P F G
3 讨 论
已有研究报道，对临床耐药白念珠菌，小檗碱与氟康唑联用后，念珠菌氟康唑耐药株对氟康唑的
敏感性比单用氟康唑时明显增强[
11-12]
㊂在小鼠体内实验同样得到了协同作用的效果[
13
]㊂在本次研究中发现，小檗碱和常用抗真菌药物
联用，超过半数的实验菌株表现出协同作用，特别是B B R /A m B ㊁B B R /V O C 联合使用时表现出了最
高的协同作用率㊂B B R 与抗真菌药物合用，可降低抗真菌药物对T M 酵母相的M I C 值,
而且与B B R 联用或许能在临床应用中减少抗真菌药物的
剂量又不影响临床疗效㊂我们的研究提示B B R 体外对马尔尼菲篮状菌具有一定的抑制作用，当与其他抗真菌药物联合使用时作用更显著㊂B B R 在肠道内被吸收的特性已被运用于胃肠炎㊁痢疾的治
疗[14
]，值得注意的是马尔尼菲篮状菌病的患者当消化道被累及时，约12.5%的患者会出现腹泻等消化道症状[15-16
]，本实验结果提示当马尔尼菲篮状
菌病累及胃肠道时,B B R 联合传统抗真菌药可能有更好的疗效，该结果将为今后中西医结合马尔尼菲篮状菌病提供理论依据㊂
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081㊃ 中国真菌学杂志2021年6月第16卷第3期 C h i n J M y
c o l ,J u n e 2021,V o l 16,N o .3
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