櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄
［２２］ＡｌｉＦ，ＢｅｈｚａｄＧ，ＮａｚａｒｉＡＨ，ｅｔａｌ．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃ
ｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆａｌｍｏｎｄＰｒｕｎｕｓｄｕｌｃｉｓ）ｕｓｉｎｇｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｍａｒｋｅｒｓａｎｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｔｒａｉｔｓ［Ｊ］．ＩｒａｎｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，６（２）：９８－１０６．
［２３］史红丽，韩明玉，赵彩平．桃遗传多样性的ＳＡＲＰ和ＳＳＲ标记分
析［
Ｊ］．华北农学报，２００９，２４（６）：１８７－１９２．［２４］周　平，郭　瑞，张小丹，等．ＳＳＲ分析５０份桃种质资源遗传多
样性［Ｊ］．福建农业学报，２０１７，３２（１）：４７－５０．
［２５］ＭａｓｓｉｍｏＶ，ＣｒｉｓｔｉｎａＣ，ＳｔｅｌｕｔａＲ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｗａｌｎｕｔ
（ＪｕｇｌａｎｓｒｅｇｉａＬ．）ｉｎｔｈｅＥａｓｔｅｒｎＩｔａｌｉａｎＡｌｐｓ［Ｊ］．Ｆｏｒｅｓｔｓ，２０１７，８（３）：８１．
［２６］ＺｈａｎｇＬＬ，ＬｉｕＸＬ，ＰｅｎｇＪＨ．Ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｔｕｎｇｔｒｅｅ
，Ｖｅｒｎｉｃｉａｆｏｒｄｉｉ（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ），ａｐｏｔｅｎｔｉａｌｂｉｏｄｉｅｓｅｌｐｌａｎｔｓｐｅｃｉｅｓｗｉｔｈｌｏｗｉｎｖａｓｉｏｎｒｉｓｋ［Ｊ］．Ａｇｒｏｎｏｍｙ，２０１９，９（７）：４０２．
［２７］ＹｅｈＦＣ，ＣｈｏｎｇＤＫ，ＹａｎｇＲＣ．ＲＡＰＤｖａｒｉａｔｉｏｎｗｉｔｈｉｎａｎｄａｍｏｎｇ
ｎａｔｕｒａｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｆｔｒｅｍｂｌｉｎｇａｓｐｅｎ（ＰｏｐｕｌｕｓｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓＭｉｃｈｘ．）ｆｒｏｍＡｌｂｅｒｔａ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｅｒｅｄｉｔｙ，１９９５，８６（６）：４５４－４６０．［２８］ＧｉｌｌｉｅｓＡＭ，ＮａｖａｒｒｏＣ，ＬｏｗｅＡＪ，ｅｔ．ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎ
Ｍｅｓｏａｍｅｒｉｃａｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｆｍａｈｏｇａｎｙ（Ｓｗｉｅｔｅｎｉａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ），ａｓｓｅｓｓｅｄｕｓｉｎｇＲＡＰＤｓ［Ｊ］．Ｈｅｒｅｄｉｔｙ，１９９９，８３（６）：７２２－７３２．［２９］王　斐，张艳杰，欧春青，等．梨品种ＳＳＲ分子鉴定体系的建立
及应用［
Ｊ］．分子植物育种，２０２１，１９（２２）：７４９９－７５０９．［３０］胡文舜，邓朝军，许奇志，等．１９个枇杷杂交新品种（系）的ＳＳＲ
鉴定和指纹图谱构建［Ｊ］．热带亚热带植物学报，２０２０，２８（２）：１５３－１６２．
曾凡松，翟亚美，袁　斌，等．小麦白粉菌ＢｇｔＶｏｓＡ、ＢｇｔＶｅｌＢ、ＢｇｔＢｒｌＡ基因的克隆及在调控无性繁殖中的作用［Ｊ］．江苏农业科学，２０２３，５１（１６）：２６－３４．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２３．１６．００４
小麦白粉菌ＢｇｔＶｏｓＡ、ＢｇｔＶｅｌＢ、ＢｇｔＢｒｌＡ基因的克隆
及在调控无性繁殖中的作用
曾凡松１，翟亚美１，袁　斌１，龚双军１，向礼波１，薛敏峰１，阙亚伟１，史文琦１，
郑　磊２，张　强２，杨立军１，喻大昭１
（１．农业农村部华中作物有害生物综合治理重点实验室／农作物重大病虫草害防控湖北省重点实验室／
湖北省农业科学院植保土肥研究所，湖北武汉４３００６４；２．山东金正大生态工程集团股份有限公司，山东临沂２７６７００）
  摘要：为了明晰小麦白粉菌ＢｇｔＶｏｓＡ、ＢｇｔＶｅｌＢ、ＢｇｔＢｒｌＡ基因的序列特点及它们在白粉菌产孢过程中的表达动态，为解析ｖｅｌｖｅｔ蛋白在调控白粉菌无性繁殖中的作用提供理论依据，采用基于ＲＮＡ－ｓｅｑ数据的克隆测序技术获得ＢｇｔＶｏｓＡ、ＢｇｔＶｅｌＢ、ＢｇｔＢｒｌＡ基因的ＣＤＳ序列，用生物信息学方法分析它们编码的蛋白质序列特征和空间结构，用ＲＴ－ｑＰＣＲ监测它们在白粉菌分生孢子形成时期的表达模式。结果表明，ＢｇｔＶｏｓＡ、ＢｇｔＶｅｌＢ、ＢｇｔＢｒｌＡ基因的ＯＲＦ长度依次为１４７０、１３４１、１１４３ｂｐ，分别编码４８９、４４６、３８０个氨基酸，分子量在５４．０～４８．０ｋｕ，属于碱性、亲水性、热不稳定蛋白质，均含有核定位信号，不含跨膜螺旋和信号肽，空间结构呈现出近球形。ＢｇｔＶｏｓＡ、ＢｇｔＶｅｌＢ、ＢｇｔＢｒｌＡ分别与其他真菌来源的ＶｏｓＡ、ＶｅｌＢ、ＢｒｌＡ蛋白具有同源性，且与白粉菌同源蛋白具有更近的亲缘关系，氨基酸序列在白粉菌自然体中均高度保守。Ｂ
ｇｔＶｏｓＡ、ＢｇｔＶｅｌＢ属于典型的ｖｅｌｖｅｔ蛋白家族成员，可能通过分子互作形成复合物，但其结构与构巢曲霉同源蛋白复合物存在明显差异。在小麦白粉菌无性繁殖阶段，ＢｇｔＶｏｓＡ、ＢｇｔＶｅｌＢ基因均显著上调（Ｐ＜０．０１），ＢｇｔＢｒｌＡ表达水平没有显著变化（Ｐ＞０．０５）。ＤＮＡ结合区域分析推测ＢｇｔＶｏｓＡ－ＢｇｔＶｅｌＢ复合物不能靶向ＢｇｔＢｒｌＡ启动子，调控其ＢｇｔＢｒｌＡ的表达。ＢｇｔＶｏｓＡ、ＢｇｔＶｅｌＢ基因在调控白粉菌无性生殖中起重要作用。  关键词：小麦白粉菌；Ｖｅｌｖｅｔ蛋白；ＢｒｌＡ基因；无性产孢；表达分析
  中图分类号：Ｓ４３５．１２１．４＋
６  文献标志码：Ａ  文章编号：１００２－１３０２（２０２３）１６－００２６－０９
收稿日期：２０２２－１１－２３
基金项目：国家小麦产业技术体系建设专项（编号：ＣＡＲＳ－３－１－２）。作者简介：曾凡松（１９８０—），男，湖北宜昌人，博士，副研究员，主要从事小麦病害防控研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｅｎｇｆａｎｓｏｎｇ２００５＠１２６．ｃｏｍ。通信作者：杨立军，博士，研究员，主要从事小麦病害防控研究。Ｅ－ｍａｉｌ：Ｙａｎｇｌｉｊｕｎ１９９３＠１６３．ｃｏｍ。
  小麦白粉病是由禾谷类白粉菌小麦专化型
（Ｂｌｕｍｅｒｉａｇｒａｍｉｎｉｓｆ．ｓｐ．ｔｒｉｔｉｃｉ，Ｂｇｔ）引起的重要病害。白粉病降低小麦的产量和品质，在我国常年发
生面积约７
００万ｈｍ２
，对小麦生产造成了严重威胁［１］。禾谷类白粉菌只能在活的寄主上生活，可通过有性生殖和无性生殖繁衍后代，其中有性生殖每年只发生１次；而无性生殖可在１个生长季节发生
很多次，产生的分生孢子不仅是无性世代的繁殖
体，而且是病害流行的主要侵染源［２］
。分生孢子落
在小麦叶片上１ｄ
后侵入寄主表皮细胞，２ｄ后形成成熟的吸器，从寄主细胞中不断汲取营养物质，３ｄ后形成大量的营养菌丝，４ｄ后进入无性生殖阶段，菌丝上开始形成足细胞，５ｄ后开始形成分生孢子梗，不断分化出分生孢子，在风力的作用下扩散传
播，导致病害迅速扩散［３］
。解析白粉菌产孢相关基
因的功能，有助于揭示白粉菌无性繁殖的分子机制，为白粉病的流行和防控提供理论依据。关于丝状真菌产孢遗传机制的研究始于对构巢曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）的研究。ＢｒｌＡ基因编码１个Ｃ２Ｈ２—锌指转录因子，它能够激活ＡｂａＡ、ＷｅｔＡ基因的表达，这３个基因组成的ＢｒｌＡ－ＡｂａＡ－ＷｅｔＡ途径
在构巢曲霉无性产孢过程中起核心调控作用［４］
。
Ｖｅｌｖｅｔ家族蛋白是丝状真菌特有的蛋白，它们具有Ｖｅｌｖｅｔ结构域，参与真菌无性、有性发育过程的调控和次生代谢产物的合成，其成员包括ＶｏｓＡ（ｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｓｐｏｒｅｓＡ）、ＶｅＡ（ｖｅｌｖｅｔ）、ＶｅｌＢ（ｖｅｌｖｅｔｌｉｋｅＢ）、
ＶｅｌＣ（ｖｅｌｖｅｔｌｉｋｅＣ）、ＶｅｌＤ（ｖｅｌｖｅｔｌｉｋｅＤ）［５－６］
。
Ｖｅｌｖｅｔ蛋白可在ＢｒｌＡ－ＡｂａＡ－ＷｅｔＡ途径下游起调控作用，其中ＶｏｓＡ能够与ＶｅｌＢ形成复合物，结合到ＢｒｌＡ的启动子区域，反馈抑制ＢｒｌＡ的表达，从而影
响分生孢子的数量和成熟［７－８］
。ＶｏｓＡ、ＶｅｌＢ能够直
接或间接地调节异源Ｇ蛋白信号转导途径和促分裂原蛋白激酶信号途径相关基因，影响真菌无性生
殖、初生代谢和次生代谢［９－１０］
。国内外关于白粉菌
ｖｅｌｖｅｔ蛋白的研究还未见报道。从已发表的小麦白粉菌基因组中到了３个含有ｖｅｌｖｅｔ结构域的蛋白，ＮＣＢＩ登录号分别为：ＥＰＱ６５５７３．１、ＥＰＱ６３７４７．１、
ＥＰＱ６７７３２．１［１１］
。
白粉菌无法在人工培养基上生长，只能在活的寄主上存活，因而很难对其进行遗传转化，基因功能研究
进展速度偏慢。本研究对小麦白粉菌２个ｖｅｌｖｅｔ蛋白ＢｇｔＶｏｓＡ、ＢｇｔＶｅｌＢ以及调控因子ＢｇｔＢｒｌＡ进行了氨基酸序列分析、功能注释、结构预测和变异位点检测，对这些基因在小麦白粉菌分生孢子形成过程中的表达谱进行了监测，旨在为揭示白粉菌无性生殖调控的分子机制奠定基础。１　材料与方法１．１　试验材料
供试的小麦白粉菌菌株Ｂｇｔ２１－２来自江苏省
盐城市［１２］
。培养白粉菌的小麦材料为感病品种
Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒ。种植小麦的土壤为含有水溶肥（山东金正大生态工程集团股份有限公司）的营养土，白粉
菌的接种、扩繁参照Ｙ
ａｎｇ等的方法［３］
。菌株在Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒ离体叶段上进行扩繁，每１２ｄ扩繁１次。１．２　基因克隆
以构巢曲霉ＡｎＶｏｓＡ、ＡｎＶｅｌＢ（ＮＣＢＩ登录号分别为ＡＢＩ５１６１８．１、ＡＢＱ１７９６７．１）和烟曲霉（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ＡｆＢｒｌＡ蛋白质序列（ＮＣＢＩ登录号ＸＰ＿７５３０２６．１）为查询序列，在已发表的参考菌株
９６２２４蛋白质数据库［１１］
中进行ＢＬＡＳＴｐ比对，获得
ＢｇｔＶｏｓＡ、ＢｇｔＶｅｌＢ、ＢｇｔＢｒｌＡ的候选蛋白。根据菌株Ｂｇｔ２１－２分生孢子形成阶段转录组测序的ｒｅａｄｓ比
对参考基因组后的数据［１３］
，获取覆盖３个基因ＯＲＦ
的ｃＤＮＡ序列。采用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ６．０软件从ＯＲＦ上游和下游设计引物，送武汉天一辉远生物科技有限公司合成。
采用醋酸纤维素包埋法［１４］
将接种５ｄ后的小
麦叶片表面的菌丝体剥离，液氮速冻后保存备用。
采用Ｔ
ｒｉｚｏｌ试剂盒和ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ
反转录试剂盒（大连宝生物科技有限公司）提取总Ｒ
ＮＡ和合成ｃＤＮＡ。以ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增。２５μＬ反应体系包含１μＬｃＤＮＡ，２．５μＬ１０×ＥｘＴａｑＰＣＲ
ｂｕｆｆｅｒ，１．２５μＬ５０ｍｍｏｌ／ＬＭｇ２＋
，０．５μＬ１０ｍｍｏｌ／Ｌ
ｄＮＴＰｓ，上下游引物各０．５μＬ，０．２５μＬＥｘＴａｑ酶（大连宝生物科技有限公司），补ｄｄＨ２Ｏ至２５μＬ。反应程序：９５℃预变性５ｍｉｎ；９５℃１０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃２．５ｍｉｎ，４０个循环；７２℃１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产物
经凝胶回收后连接到Ｔ－ｖｅｃｔｏｒｐＭＤＴＭ
１９，送武汉天
一辉远生物科技有限公司测序。为检测目的基因ＤＮＡ序列变异，采用ＣＴＡＢ法提取菌株分生孢子样
品中的基因组ＤＮＡ［１５］
。用相同的方法进行ＰＣＲ扩
增、产物连接和序列测定。１．３　基因序列特征分析
采用ＤＮＡＭＡＮｖ６．０软件和ＮＣＢＩＯＲＦｆｉｎｄｅｒ工具对基因编码区进行序列分析。采用ＥｘＰＡＳｙ－ＰｒｏｔＰａｒａｍ和ＥｘＰＡＳｙ－Ｓｃａｌｅ工具分析蛋白质氨基酸的理化性质，包括分子量、理论等电点、脂肪指数和
亲水性指数［１６］
。采用ＳｉｎａｌＰｖ５．０、ＮＬＳｔｒａｄａｍｕｓ和
ＴＭＨＭＭｖ２．０等软件预测蛋白质的信号肽、核定位
信号和跨膜区［
１７－１９］
。采用ＭＥＭＥＳｕｉｔｅｖ５．５．０进行ｍｏｔｉｆ分析。采用Ｉ－ＴＡＳＳＥＲ在线工具计算Ｂ－因子（Ｂ－ｆａｃｔｏｒ），预测蛋白质二级结构和三级
结构［２０］
。采用ＺＤＯＣＫＳｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｚｄｏｃｋ．
ｕｍａｓｓｍｅｄ．ｅｄｕ／）进行蛋白之间的分子对接［２１］。１．４　系统发育树的构建
将目标蛋白质序列在ＮＣＢＩｎｒ蛋白质数据库中进行ＢＬＡＳＴｐ比对，搜索并下载同源序列。采用ＭＥＧＡｖ６．０软件和邻接法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄ）进行序列比对和系统发育树构建［２２］，并进行ｂｏｏｔｓｔｒａｐ１０００次重复检验。
１．５　表达谱分析
在接种菌株Ｂｇｔ２１－２后３ｄｐｉ（菌丝生长期）、４ｄｐｉ（足细胞发育期）和５ｄｐｉ（分生孢子梗发育期），取感染的小麦离体叶段进行台盼蓝染，显微观察和拍照。采用醋酸纤维素包埋法收集３个时间点的叶表面菌体，每个时间点样品重复３次。总ＲＮＡ的提取和ｃＤＮＡ合成方法同“１．２
”节。根据“１．２”节方法克隆的目标基因的ＯＲＦ序列，设计引物送武汉天一辉远生物科技有限公司合成。ＰＣＲ反应体系采用２×Ｑ３ＳＹＢＲｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ－ＵｎｉｖｅｒｓａｌＫｉｔ（吐露港生物科技有限公司）配制。ＰＣＲ反应参照Ｈａｃｑｕａｒｄ等的方法［１４］执行。ＰＣＲ反应在ＡＢＩ７５００ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ仪上完成，每个反应重复３次。采用２－ΔΔＣＴ方法和ＳＰＳＳｖ２６．０软件计算基因相对表达量和统计分析［２３］。
２　结果与分析
２．１　ＢｇｔＶｏｓＡ、ＢｇｔＶｅｌＢ、ＢｇｔＢｒｌＡ基因的克隆
通过ＢＬＡＳＴｐ比对从菌株９６２２４基因组中获得了候选ＢｇｔＶｏｓＡ、ＢｇｔＶｅｌＢ、ＢｇｔＢｒｌＡ蛋白序列，ＮＣＢＩ登录号分别为ＥＰＱ６３７４７．１、ＥＰＱ６５５７３．１、ＥＰＱ６３９８０．１。根据菌株Ｂｇｔ２１－２转录组ｒｅａｄｓ覆盖参考基因组区段，从非编码区设计了特异性ＰＣＲ引物对（表１）。以５ｄｐｉ菌体样品总ＲＮＡ反转录生成的ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，分别获得了覆盖ＢｇｔＶｏｓＡ、ＢｇｔＶｅｌＢ、ＢｇｔＢｒｌＡ等３个基因完整ＯＲＦ区域的ｃＤＮＡ序列，包含完整的ＯＲＦ区域长度，分别为１４７０、１３４１、１１４３ｂｐ，编码４８９、４４６、３８０个氨基酸（图１），其中ＢｇｔＶｏｓＡ、ＢｇｔＶｅｌＢ各含有３、４个内含子，ＢｇｔＢｒｌＡ不含内含子（图２）。
２．２　ＢｇｔＶｏｓＡ、ＢｇｔＶｅｌＢ、ＢｇｔＢｒｌＡ蛋白的理化性质、序列特征和功能注释
ＢｇｔＶｏｓＡ、ＢｇｔＶｅｌＢ、ＢｇｔＢｒｌＡ这３个基因编码的蛋白质的分子量分别为５４．６、４７．８、４３．７ｋｕ，等电点为７．２～８．０，均属于偏碱性蛋白质。这些蛋白亲水指数（ＧＲＡＶＹ）为－０．９３～－０．５０，脂肪指数为４２．０～
表１　用于基因克隆和表达量检测的ＰＣＲ引物
用途引物名称序列（５′→３′）
目标基因序列扩增ＢｇｔＶｏｓＡ－ｃＤＮＡ－ＦＣＡＣＡＣＴＡＡＴＣＣＡＣＣＡＡＧＣＣＣ
ＢｇｔＶｏｓＡ－ｃＤＮＡ－ＲＴＡＣＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＧＣＣＣＡＧ
ＢｇｔＶｅｌＢ－ｃＤＮＡ－ＦＣＡＡＧＴＣＧＣＣＧＴＴＡＧＡＣＣＴＣＡＴ
ＢｇｔＶｅｌＢ－ｃＤＮＡ－ＲＧＡＣＴＡＣＣＧＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＧ
ＢｇｔＢｒｌＡ－ｃＤＮＡ－ＦＴＧＴＴＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＧＴＣ
ＢｇｔＢｒｌＡ－ｃＤＮＡ－ＲＡＡＡＡＧＴＴＴＡＣＣＧＣＣＣＣＴＣＣＧ目标基因表达量测定Ｂｇ
ｔＶｏｓＡ－ｅｘｐ－ＦＧＧＣＡＡＴＣＡＡＴＣＡＣＡＡＣＣＡＡ
ＢｇｔＶｏｓＡ－ｅｘｐ－ＲＡＧＧＣＴＣＴＣＣＡＧＴＧＴＣＴＡＴ
ＢｇｔＶｅｌＢ－ｅｘｐ－ＦＣＧＴＣＴＴＣＡＧＣＧＴＣＴＡＣＴＣ
ＢｇｔＶｅｌＢ－ｅｘｐ－ＲＣＧＴＣＴＴＴＧＣＧＡＡＴＡＧＧＧＡＴ
ＢｇｔＢｒｌＡ－ｅｘｐ－ＦＣＴＧＴＧＣＣＣＴＡＣＣＡＣＡＡＴＧＣＴ
ＢｇｔＢｒｌＡ－ｅｘｐ－ＲＧＴＣＡＡＧＣＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＧＡＴ内参基因的扩增β－ｔｕｂ－ＦＧＣＴＡＴＴＣＡＧＡＣＣＡＧＡＣＡＡＣＴ
β－ｔｕｂ－ＦＣＴＴＣＴＣＴＴＣＧＣＡＣＣＡＣＡＴ
５９．０，提示它们都是亲水性、热不稳定蛋白。３个蛋白均不含跨膜区和信号肽（表２）。ＢｇｔＶｏｓＡ、ＢｇｔＶｅｌＢ、ＢｇｔＢｒｌＡ蛋白的核定位信号分别位于第１９１～２０４位氨基酸（ＲＶＲＫＥＱＮＲＴＬＩＲＫＲ）、第４３１～４３７位氨基酸（ＲＫＤＡＡＫＧ）、第３２５～３５８位氨基酸（ＤＫＧＧＰＤＲＰＮＲＲＴＱＹＦＫＤＡＧＫＩＩＫＡＭＳＲＲＧＧＫＬＦＳ）。ＢｇｔＶｏｓＡ、ＢｇｔＶｅｌＢ具有典型的ｖｅｌｖｅｔ结构域（Ｐｆａｍ数据库：ＰＦ１１７５４．１１；
Ｉｎｔｅｒｐｒｏ数据库：ＩＰＲ０３７５２５），属于ｖｅｌｖｅｔ蛋白。ＢｇｔＢｒｌＡ蛋白是１个Ｃ
２
Ｈ
２
型锌指蛋白（Ｐｆａｍ数据库：ＰＦ０２２００．１９；ＰＦ１３４６５．９；Ｉｎｔｅｒｐｒｏ数据库：ＩＰＲ０１３０８７），具有结合ＤＮＡ和调控转录的功能，推测为１个转录因子（图２）。
２．３　ＢｇｔＶｏｓＡ、ＢｇｔＶｅｌＢ、ＢｇｔＢｒｌＡ蛋白的系统进化分析
选择同源蛋白质序列分别构建ＢｇｔＶｏｓＡ、ＢｇｔＶｅｌＢ、ＢｇｔＢｒｌＡ的系统进化树（图３）。ＢｇｔＶｏｓＡ与来自白粉菌的同源蛋白能聚到１个较大的分支中。小麦白粉菌、小黑麦白粉菌、大麦白粉菌等禾谷类白粉菌的同源蛋白之间的亲缘关系最近，处在同１个小分支中。它们与来自拟兰芥白粉菌等双子叶植物上白粉菌的同源蛋白也具有较近的亲缘关系。ＢｇｔＶｅｌＢ、ＢｇｔＢｒｌＡ呈现出类似的结果，但不同的是，来自白粉菌的同源蛋白与来自腐生生活真菌的同源蛋白分别处在彼此独立的分支中，表现出更远的进化距离。
  同源蛋白的模体分析表明，从ＢｇｔＶｏｓＡ、ＢｇｔＶｅｌＢ、ＢｇｔＢｒｌＡ的同源蛋白中分别到了１０、６、５个保守的模体。２３个ＶｏｓＡ同源蛋白均含有Ｍｏｔｉｆ１、
表２　ＢｇｔＶｏｓＡ、ＢｇｔＶｅｌＢ、ＢｇｔＢｒｌＡ蛋白质生物信息学特征分析
蛋白成熟多肽
长度
分子量
（ｕ）
理论
等电点
（ｐＩ）
脂肪
指数
亲水性
指数
信号
肽数
核定位
q空间背景音乐克隆信号
跨膜
螺旋数
结构域
ＢｇｔＶｏｓＡ４８９５４５５０．６７．２３５６．８９－０．７２７０１９１－２０４ａａ０Ｖｅｌｖｅｔ结构域（第２９～９３位氨基酸；第８６～１９７位氨基酸）ＢｇｔＶｅｌＢ４４６４７７７２．０７．２９５８．０７－０．５３００４３１－４３７ａａ０Ｖｅｌｖｅｔ结构域（第１１３～４
３４位氨基酸）
ＢｇｔＢｒｌＡ３８０４３６５６．５７．９７４２．６６－０．９２７０３２５－３５８ａａ０Ｃ２Ｈ２型锌指蛋白
Ｍｏｔｉｆ２、Ｍｏｔｉｆ３、Ｍｏｔｉｆ４，它们的注释为ｖｅｌｖｅｔ蛋白结构域。在２５个ＶｅｌＢ同源蛋白序列中发现了４个保守的模体，分别为Ｍｏｔｉｆ１、Ｍｏｔｉｆ２、Ｍｏｔｉｆ３、Ｍｏｔｉｆ４，它们均为ｖｅｌｖｅｔ蛋白结构域。１８个ＢｒｌＡ同源蛋白中高度保守的模体包括Ｍｏｔｉｆ１、Ｍｏｔｉｆ２、Ｍｏｔｉｆ４、Ｍｏｔｉｆ５，其中Ｍｏｔｉｆ１、Ｍｏｔｉｆ２为锌指结构域，Ｍｏｔｉｆ５为核定位信号序列（图３）。
２．４　ＢｇｔＶｏｓＡ、ＢｇｔＶｅｌＢ、ＢｇｔＢｒｌＡ蛋白二级和三级结构分析
ＢｇｔＶｏｓＡ的二级结构含有４个α螺旋和９个延