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获得性人类免疫缺陷综合症简称艾滋病，是由人类免疫缺陷病毒(human Immunodeficiency virus,HIV)引起的一种慢性传染病。HIV 在我国的流行始于1985年，经过散发期、蔓延期后，于1995年进入了快速增长
期,HIV 感染在全国范围内急剧上升，如不采取有效的控制措施，今后将会有更多的HIV 感染者。中国自1996年在静脉人(IDU)中发现首例本土HIV 感染者以来，感染人数逐年上升。而柳州市是艾滋病疫情
严重的地区之一，感染方式主要以性传播、静脉为主。了解近几年柳州市者HIV-1病毒流行株亚型分布及耐药情况，对于防控柳州市艾滋病的传播、有重大意义。
DOI:10.16659/jki.1672-5654.2016.25.081
柳州市16例者HIV-1病毒流行株亚型分布及
耐药情况分析
陈柳军，余钧池，黄萍，钟祥海，刘鑫柳州市疾病预防控制中心，广西柳州
545007
[摘要]目的了解2011—2013年柳州市人人类免疫缺陷病毒1(human immunodeficiency virus 1,HIV-1)亚型分布和毒株耐药情况。方法从2011—2013年柳州市人HIV-1感染者中，随机抽取16例作为研究对象，从血浆中抽提核酸RNA，用RT-PCR 进行gag 及pol 基因扩增，并对扩增产物进行测序和序列分析。结果16例标本中存在2种HIV-1亚型：重组亚型CRF01_AE 14例(87.5%)，重组亚型CRF07_BC 2例(12.5%)。6株发生相关耐药突变，主要发生在NRTIs 和NNRTIs 相关突变。结论2011~2013年柳州市人HIV-1感染主要以CRF01_AE 为主，主要在NRTIs 和NNRTIs 相关耐药突变。[关键词]HIV-1；人；基因亚型；耐药[中图分类号]R52
[文献标识码]A
[文章编号]1672-5654(2016)09(a)-0081-03
Analysis of HIV-1Virus Epidemic Strain Subtype Distribution in 16Cases
of Drug Users in Liuzhou and Drug Resistance
CHEN Liu-jun,YU Jun-chi,HUANG Ping,ZHONG Xiang-hai,LIU Xin
Center for Disease Prevention and Control,Liuzhou,Guangxi Province,545007China
[Abstract]Objective To know the HIV-1virus epidemic strain subtype distribution in drug users in Liuzhou from 2011to 2013and drug resistance.Methods 16cases of HIV-1infected persons in the drug users in Liuzhou from 2011to 2013were randomly selected as the research objects,and the nucleic acid RNA was extracted from blood plasma,RT-PCR was used for gag and pol gene amplification,and the amplification products were given sequencing and sequential analysis.Re⁃sults In the 16cases of specimens,there were 2HIV-1subtypes,14cases of reconstruction subtypes CRF01_AE (87.5%),and 2cases of reconstruction subtypes CRF07_BC(12.5%),the related drug resistance mutation occurred to 6strains,and NRTIs and NNRTIs related mutations were the main.Conclusion The HIV-1infection of drug users in Liuzhou from 2011
to 2013was mostly CRF01_AE,and the NRTIs and NNRTIs related mutations were the main.
[Key words]HIV-1;Drug user;Gene subtype;Drug resistance
[课题资助]广西科学技术厅立项课题(项目编号：桂科攻1140003A-44)；广西卫生厅资助课题(项目编号:Z2007289)。[作者简介]陈柳军(1966.11-)，男，广西柳州人，本科，副主任
检验技师，研究方向：病原微生物检测。
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Preventive medicine and public health 预防医学与公共卫生
1材料与方法1.1标本来源
从2011—2013年柳州市人HIV 感染者中，随机抽取16例。所有研究对象均经免疫印迹实验(WB)确认为HIV-1阳性。1.2主要试剂
病毒DNA /RNA 提取试剂盒购自西安天隆公司、核酸扩增试剂盒PrimeScript one step RT -PCR、Premix TaqTM、LA TaqTM Version 2.0plus dye 和普通琼脂糖购自大连宝生物TaKaRa。1.3核酸提取尧扩增及测序
使用病毒DNA /RNA 提取试剂盒从200μL 保存好的血浆中提取HIV RNA，采用巢式PCR 方法扩增HIV-1
gag、pol 基因片段，扩增引物如表1所示。巢式PCR 第一步扩增使用PrimeScript one step RT-PCR 试剂盒,
第二步扩增采用Premix TaqTM LA TaqTM Version 2.0plus dye 试剂盒。第二步扩增产物经琼脂糖电泳验证后，送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。
表1扩增gag、pol 基因片段的反应引物1.4亚型分析
用Chromas 查看测序所得序列,Vector NTI Suite 10的Contig Express 进行序列拼接,ClustalX2进行序列比对，经BioEdit 序列比对、修饰后，用MEGA 5软件的Neighbor-Joining 法构建系统进化树，所得进化树用Bootstrap 法检验(重复500次)，根据序列与参考序列的
聚集情况确定病毒亚型，参考序列均来自Los Alamos National Laboratory HIV database(www.v/)。1.5耐药性分析
将测序所得pol 基因序列提交至美国斯坦福大学HIV 耐药性数据库(Stanford University HIV Drug Resista nce Database,hivdb.stanford.edu/)，点击进入HIV db PROGRA，输入已测序列即可获得各序列的耐药位点及相关耐药信息。2结果2.1基因分型
16份样本成功扩增测序得到14条gag 和11条pol
基因片段，将基因序列输入到HIV BLAST 中，发现CRF01_AE 14例，占87.5%(14/16),CRF07_BC 2例，占12.5%(2/16)。将gag 基因片段序列与典型高频参考序
列进行比对，应用MEGA 5软件构建系统进化树，见图1，图中实心圆圈“●”代表典型的高频出现的共享序列，黑实心三角“▲”代表测序后的基因片段。从系统进化树可以看出，重组亚型CRF01_AE 高频参考序列出现的城市主要来自广西、福建、江苏、辽宁、四川，重组亚型CRF07_BC 对应的高频参考序列出现的城市主要有广西、北京、新疆。2.2耐药分析
在获得的基因序列中，有6株产生耐药相关突变，见表1。蛋白酶抑制剂(PIs)相关突变有一种，为L10V；核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)相关突变有7种，分别为T69N、V75C、A62V、F116Y、Q151M、M184V 和K65R;
非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)相关突变有五种，分别为Y181C、K101H、G190A、L100I 和K103N。耐药性分析发现,PIs 相关突变为潜在低度耐药，不会引起病毒对药物敏感性的改变；在NRTIs 相关突变中,Q151M 突变或M184V 突变可引起毒株对拉米夫定(3TC)和恩去他滨(FTC)产生高度耐药,K65R 突变可引起毒株对替诺福韦(TDF)、双脱氧肌苷(ddI)、阿巴卡韦(ABC)和司他夫定(d4T)产生中度或高度耐药；在NNRTIs 相关突变中,K103N 突变可引起毒株对奈韦拉平(NVP)产生高度耐药,G190A 突变可引起毒株对NVP 产生高度耐药及对依非韦仑(EFV)中度耐药。见表2。值得引起注意的是，在11例患者中，有2例患者出现了NRTIs,NNRTIs 双突变。
表2
HIV-1流行株耐药相关突变位点及种类
gag OF gag OR gag IF gag IR
pol OF pol OR pol IF
pol IR
引物名称ATGGGTGCGAGAGCGTCARTATTAA TCCAACAGCCCTTTTTCCTAGG
GGGAAAAAATTCGGTTAAGGCC
TAGTTC
CTGCTATRTCACTTCC
GGGTTTTGGCTGAGGCAATGAG
GCTTGCCAATACTCCRTCCACCA
GTTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC
CTTTTGATGGGTCATAATATACTCCATG
碱基方向5’-3’
790~8142032~2011836~8571507~14861871~18923772~37502027~20503519~3492
外侧引物内侧引物
外侧引物内侧引物
在HXB2位置引物方向
2LZ0142LZ0262LZ0274LZ0104LZ0154LZ022
标本编号--L10V
---PIs 相关突变
-T69N -V75C A62V,F116Y,Q151M,M184V
K65R,M184V
Y181C ---
K101H,G190A L100I,K103N
NRTIs 相关突变
NNRTIs 相关突变
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3讨论
该研究对柳州市16例者HIV-1病毒流行株进行基因亚型分析，发现柳州市人HIV-1亚型主要以重组亚型CRF01_AE 为主，其次为重组亚型CRF07_BC，没有发现重组亚型CRF08_BC，这与广西HIV 分子流行病学调查结论一致[1]。其中,CRF01_AE 与广西、福建、江苏、辽宁、四川流行株的相似性较高,CRF07_BC 与广西，北京。新疆流行株的相似性较高。在上世纪90年代，中国首次在云南和广西确认CRF01_AE 重组型毒株，随后在性传播和高危人中传播[2-3]，在2006年的全国HIV 分子流行病学调查中发现,CRF01_AE 重组型毒株已迅速成为我国最广泛流行的毒株[4-5]，至今在各个感染途径中，仍占主要位置。由于柳州市人HIV-1亚型没有发现CRF08_BC，而广西全省流行的HIV-1亚型存在有CRF01_AE、CRF07_BC、
CRF08_BC、CRF55_01B 和B 型，因此对柳州市人的HIV 防治工作，应制定符合本地方特的策略，方能更好地控制HIV 的蔓延。
从该次耐药研究中发现，人HIV-1感染者经过抗病毒后已有部分感染者产生耐药,PIs 相关突变为潜在低度耐药，不会引起病毒对药物敏感性的改变;NRTIs 相关突变存在着Q151M 突变、M184V 突变及K65R 突变，该突变可引起HIV-1毒株对3TC、FTC、TDF、ddI、ABC 和d4T 产生中度或高度耐药;NNRTIs 相关突变存在着K103N 突变和G190A 突变，该突变可引起毒株对NVP 和EFV 产生中度或高度耐药。随着柳州市抗病毒人的增加，人的耐药情况也会越发严重，并可能发生扩散，这对柳州市艾滋病防控、提出了严峻考验。由于该次研究样本量较少，而对于HIV-1流行株耐药情况
分析，需进行连续动态监测，方能及时发现新的耐药情况。因此，今后需加强该方面的监测工作，为柳州市HIV-1抗病毒和防止耐药株传播提供技术支持。
[参考文献]
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(收稿日期:2016-05-25)
图1
基于gag 基因片段序列构建的进化树
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