白念珠菌二相性与毒力关系的实验研究
苑天红1，王明永2，吴升伟1，王正蓉1，吴承龙1
  [摘　要]　目的　探讨白念珠菌二相性与毒力的关系。方法　分别将孢子相、菌丝相白念珠菌与人口腔颊黏膜细胞(BEC)进行黏附试验，比较二相性白念珠菌对BEC的黏附率；分别用牛血清白蛋白培养基及卵黄培养基测定二相性白念珠菌的分泌性酸性蛋白酶与细胞外磷脂酶的活力；分别将二相性白念珠菌进行小鼠毒力实验。结果　菌丝相白念珠菌对BEC的黏附率显著高于孢子相(P<0.001)；菌丝相白念珠菌分泌性酸性蛋白酶与细胞外磷脂酶的活力均显著高于孢子相(P分别<0.001和<0.002)；注射菌丝相白念珠菌的小鼠死亡率高于注射孢子相的小鼠(P<0.025)，且平均存活期低于注射孢子相的小鼠(P<0.001)。结论　菌丝相白念珠菌的毒力强于孢子相。
[关键词]　白念珠菌；二相性；毒力
[中图分类号]　R379.4  　[文献标识码]　A  　[文章编号]　1001-7089(2004)10-0580-02
Experimental Study on C orrelation between Dimorphism and Virulence in Candida Albicans
Y UAN T ian-hong,WANG M ing-yong,W U Sheng-w ei,et al
(Department of Micro biology,Guiyang Medical College,Guiyang550004,China)
Abstract:　Objective　T o study the correlation betw een dimo rphism and virulence in Candida albicans.M ethods　Yeast forms and hy phal fo rms of Candida albicans were used respectiv ely to bind to buccal epithelial cells(BEC)in vitro and compare the adherence rates of hyphal forms with tha t of y east forms.Bovine serum albumin(BSA)medium and egg-yelk containing medium w ere used respectively to test the activities of secretory acid pro teinase and extracellular phospholipase in dimorphic Can-dida albicans;T wo forms of Candida albicans w ere injected to murine respectively in virulence test.Results　T he adherence rate of hy phal forms to BEC was sig nificantly higher than that of y east forms(P<0.001,P<0.002,respectively);The activities of se-cretory acid proteinase and extracellular phospholipase in hyphal forms were sig nificantly higher than tha t of yeast forms(P<0. 001);M or tality rate o f murine w hich injected hyphal forms w as higher than that of murine which injected y east fo rms(P<0. 025)and average surviv al period of murine which injected hyphal forms was lower than that of murine w hich injected y east forms (P<0.001).C onclusion　T he virulence of hy phal fo rms was g reater than that o f y east forms in Candida albicans.
Key words:　Candida albicans;Dimorphism;Virulence
  白念珠菌是人类最常见的条件致病性真菌之一，可引起皮肤黏膜及内脏的广泛感染。白念珠菌是单细胞假菌丝酵母菌，形态上具有二相性，即菌丝相和孢子相。究竟哪一相毒力更强，至今尚无定论。
目前认为白念珠菌的毒力与其对宿主细胞的黏附力及产生的分泌性酸性蛋白酶与细胞外磷脂酶的活力等因素有重要关系[1]。本实验对白念珠菌的二相性与毒力的关系进行了初步探讨，进而为临床上深入了解白念珠菌的致病性与防治提供实验依据。
1　材料和方法
美人天下片头曲1.1　材料
1.1.1　菌株　白念珠菌标准株C1j为中国微生物菌种保藏管理委员会提供。
　[作者单位]　1贵阳医学院微生物学教研室，贵州贵阳　550004;2河南新乡医学院微生物学与免疫学教研室，河南新乡　453003
　[作者简介]　苑天红(1972-)，女，贵州省贵阳市人，讲师，医学硕士，研究方向为医学真菌学。1.1.2　主要试剂　①YEPD培养基(Gibco公司),②199细胞培养基(Sigma公司),③蛋白胨(Sigm a公司),④酵母浸膏(北京邦定泰克公司),⑤牛血清白蛋白(上海华美公司)。
1.1.3　动物　昆明小白鼠(清洁级)，雌雄随机，体重18～20g/只，贵阳医学院实验动物中心提供。
1.2　方法
1.2.1　二相性白念珠菌与人口腔颊黏膜细胞(BEC)之间的黏附实验[2]　将白念珠菌标准株C1j分别接种于YEPD培养基及199细胞培养基中，得孢子相及菌丝相白念珠菌。分别将二种相白念珠菌用灭菌0.01 mol/L pH7.2的PBS液离心洗涤3次(300g×3 min)，将二种相白念珠菌的浓度均调至106/ml。取受检者(正常学员20例，每次实验来自同一人)两侧颊黏膜，用上述PBS液离心洗涤3次，将口腔颊黏膜细胞浓度调至105/ml。取20支无菌Ep管，加入上述孢子相白念珠菌各0.1ml，再分别与上述不同人的颊黏膜细胞0.1ml等量混匀,37℃180r/min振荡培养2h，进行黏附试验，计算黏附率。菌丝相白念珠菌与BEC
over my head的黏附试验步骤同上。
1.2.2　二相性白念珠菌分泌性酸性蛋白酶活力的测定　参照文献[3]的方法，制备BSA培养基。分别将上述20份孢子相与菌丝相白念珠菌(106/m l)10μl滴入BSA培养基上，每份标本滴2个点。同时做蛋白酶活力阳性和阴性对照，以避免不同批号试剂对测定结果的影响。平皿于28℃培养1周，氨基黑染后洗涤。蛋白酶阳性菌株的菌落周围会产生一透明圈，测量菌落直径及透明圈直径。以PA值表示分泌性酸性蛋白酶活力,PA=菌落直径/总直径(菌落直径+透明圈)。PA值越低，分泌性酸性蛋白酶活力越强,PA值=1. 0，说明分泌性酸性蛋白酶活力阴性。
1.2.3　二相性白念珠菌细胞外磷脂酶活力的测定　参照文献[4]的方法，制备卵黄培养基。分别将上述
20份孢子相与菌丝相白念珠菌(106/ml)10μl滴入卵黄培养基上，每份标本滴2个点。同时做磷脂酶活力阳性和阴性对照，以避免不同批号试剂对测定结果的影响。平皿于35℃培养48h。磷脂酶阳性菌株的菌落周围会产生一透明圈，测量菌落直径及透明圈直径。以PZ值表示细胞外磷脂酶活力,PZ=菌落直径/总直径(菌落直径+透明圈)。PZ值越低，其活力越强,PZ 值=1.0，说明细胞外磷脂酶活力阴性。
1.2.4　二相性白念珠菌小鼠毒力试验　小鼠40只，随机分两组，每组20只。孢子相组予鼠尾静脉注射孢子相白念珠菌；菌丝相组予鼠尾静脉注射菌丝相白念珠菌。注射菌量为106/只。观察30天内小鼠死亡数及存活天数，计算小鼠死亡率及平均存活期。
1.3　统计学处理　应用SPSS10.0统计软件，计量资料均以x±s表示，进行t检验，计数资料进行χ2检验，以P<0.05为有显著性意义。
2　结果
2.1　二相性白念珠菌对BEC的粘附率比较　孢子相白念珠菌对BEC的粘附率为20.8±4.19；菌丝相BEC为35.7±
3.33。二者比较差异有显著性(t=12. 45,P<0.001)。文章出轨恋姚笛
2.2　二相性白念珠菌分泌性酸性蛋白酶与细胞外磷脂酶的活力测定　见表1。菌丝相白念珠菌分泌性
酸性蛋白酶及细胞外磷脂酶的活力均强于孢子相(t分别为4.00,
3.66;P分别<0.001和<0.002)。
2.3　二相性白念珠菌毒力试验结果　见表2。注射菌丝相白念珠菌的小鼠死亡率显著高于注射孢子相的小鼠(χ2=5.23,P<0.025)，且注射菌丝相白念珠菌的小鼠平均存活期显著低于注射孢子相的小鼠(t=16.78,P<0.001)。
表1　二相性白念珠菌分泌性酸性蛋白酶与细胞外磷脂酶
活力测定结果　(x±s)
组别PA值PZ值孢子相组0.662±0.0450.873±0.072
菌丝相组0.583±0.076＊0.792±0.068＊＊
注:＊t=4.00,P<0.001;＊＊t=3.66,P<0.002。
表2　二相性白念珠菌小鼠毒力实验结果组别小鼠数死亡数死亡率(%)
平均存活期(d)
(x±s)孢子相组20420.0018.20±0.83
菌丝相组201155.00＊12.35±1.32＊＊注:＊χ2=5.23,P<0.025;＊＊t=16.78,P<0.001。
稻香 周杰伦3　讨论
近年来，口腔念珠菌病的发病率明显增加，尤其是白念珠菌引起的口腔念珠菌病，占所有口腔念珠菌病的首位[1]。白念珠菌黏附于宿主细胞上，是感染发生的第一步和必要条件。二相性白念珠菌对宿主细胞的黏附作用，哪一相更强，目前尚无定论。本实验发现菌丝相白念珠菌对人口腔颊粘膜细胞的黏附作用强于孢子相，而白念珠菌粘附于口腔颊黏膜细胞上，是引起口腔念珠菌病的先决条件，说明菌丝相白念珠菌更易引发口腔念珠菌病。目前认为白念珠菌的侵袭性与其产生的分泌性酸性蛋白酶活力有关，且其黏附力与蛋白酶分泌量成平行关系。含此酶的菌株可分解白蛋白、免疫球蛋白及皮肤蛋白，缺乏此酶的菌株对小鼠的侵袭力明显降低[5]。分离自血液、鹅口疮及念珠菌性阴道炎的菌株PA值明显低于健康带菌者[3]。对白念珠菌细胞外磷脂酶的研究发现，对小鼠致病性高的菌株该酶的活力也高，此酶被认为是白念珠菌血源性感染的重要毒力因子[6]；外阴阴道念珠菌病患者细胞外磷脂酶的检出率及酶活力均显著高于健康携带者[4]。本实验发现菌丝相白念珠菌分泌性酸性蛋白酶与细胞外磷脂酶的活力均强于孢子相，且小鼠毒力实验显示，注射菌丝相白念珠菌的小鼠死亡率高于注射孢子相的小鼠，而其平均存活期低于注射孢子相的小鼠。说明菌丝相白念珠菌的毒力强于孢子相。
小s年龄
由此推测，如能有效地阻止孢子相白念珠菌向菌丝相白念珠菌转变，就可降低白念珠菌对口腔颊黏膜细胞的黏附，降低其分泌的细胞外磷脂酶与分泌性酸性蛋白酶的活力，从而降低白念珠菌的毒力。本研究为临床上防治白念珠菌感染打下了基础。
(下转第614页)
苄星青霉素联合强的松预防梅毒中吉海
反应发生的临床观察
The Clinical Observation of Jarisch-Herxheimer Reaction in the Course of Treating Syphilis with
Benzathine Benzylpenicillin and Prednisone
林爱华，顾跃英，程浩，高锦程，虞海燕，岑建萍
LIN Ai-hua,G U Yue-ying,CHENG Hao,GAO Jin-cheng,YU Hai-y an,CEN Jian-ping
  [摘　要]　目的　探讨如何减少因注射苄星青霉素梅毒而发生的吉海反应。方法　将164例梅毒患者随机分为两组,A组患者单纯注射苄星青霉素,B组患者注射苄星青霉素同时加服强的松。观察两组
吉海反应。结果　第1周B 组吉海反应发生率显著低于A组(P<0.0001)。结论　梅毒患者肌注苄星青霉素同时口服强的松，吉海反应发生率显著降低，可以提高梅毒的安全性。
[关键词]　梅毒；吉海反应
[中图分类号]　R759.1  　[文献标识码]　B  　[文章编号]　1001-7089(2004)10-0614-01
  梅毒为性传播疾病，近年来发病率大大升高。青霉素是梅毒的首选药，但常发生不良反应(吉海反应)。本科选用肌肉注射苄星青霉素240万u梅毒，由于第1周吉海反应发生率高，故采用第1周加服强的松10mg,3次/d，共3天，吉海反应显著降低。现报告如下。
1　资料和方法
1.1　临床资料　1995年1月～2001年3月梅毒患者164例，随机分为A组和B组，两组年龄、性别和梅毒分期差异无显著性，具有可比性，两组资料见表1。青霉素过敏者除外。
1.2　方法　所有患者均在青霉素皮试阴性后，在臀大肌处快速注射苄星青霉素(江西东风药业股份有限公司生产)240万u，每侧120万u，休息15min，当时均无不适反应，每周1次，共3周(I期梅毒为2周)。B组除以上外同时加服强的松10 mg,3次/d，共3天。记录两组吉海反应发生情况。
2　结果
B组第1周注射苄星青霉素后出现发热、头痛3例
　[作者单位]　浙江大学医学院附属邵逸夫医院，浙江杭州　310016　[作者简介]　林爱华(1968-)，女，浙江省临海市人，主治医师，医学学士。(3.03%)，出现皮疹1例(1.01%)，共4例(4.04%)出现吉海反应；而A组第1周注射苄星青霉素后出现发热、头痛18例(27.69%)，恶心、呕吐7例(10.77%)，皮疹5例(7.69%)，其他不适2例(3.07%)，共32例(49.23%)出现吉海反应。经卡方检验，两组吉海反应发生率比较差异有显著性(χ2=45.60,P <0.0001)。
表1　两组临床资料
组别例数
性别(例)
男女
年龄(岁)
最大最小平均
梅毒分期(例)
Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期隐性A组6534316713313615113 B组9956435617295525019
沧海一笑3　讨论
强的松为肾上腺皮质激素类药物，具有抑制免疫、抗炎及抗休克等作用，可以降低螺旋体抗原对机体激发的过敏反应。从本观察结果看，梅毒患者肌注苄星青霉素同时口服强的松，吉海反应发生率显著降低，可以提高梅毒的安全性。
医生应告知梅毒患者中可能出现的不良反应，使其有心理准备。一旦发生不良反应应及时到医院，不致引起患者恐慌。同时也应告知患者，让其配偶或性伴一起接受检查与，有利于梅毒的控制和预防复发。
[收稿日期]　2004-02-04　[修回日期]　2004-07-30
(上接第581页)
[参　考　文　献]
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蛋白酶活力的测定[J].中国皮肤性病学杂志,2001,15(6):375-376.[4]韩永智，骆志成，武三卯，等.阴道白念珠菌细胞外磷脂酶活力测定
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[收稿日期]　2004-06-09　[修回日期]　2004-08-11