植物体内的可溶性蛋白质含量是一个重要的生理生化指标，如在研究每一种酶的作用时常以比活(酶活力单位／毫克蛋白质，unIT／Mg ProTeIn)表示酶活力大小及酶制剂纯度，这就需要测定蛋白质含量。常用的测定方法有LoWry法和考马斯亮蓝G－250染法，本实验将分别介绍这两种方法。
方法一：LoWry法(劳里法)
【原理】
LoWry法是双缩脲法(BIureT)和福林酚法(ＦolIn－酚)的结合与发展。其原理是蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应，形成铜—蛋白质的络合盐。再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸(PHosPHoMolyBdATe ＆ PHosPHoTungsTATe)，使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。这种溶液蓝的深浅与蛋白
的含量成正相关，所以可以用于蛋白质含量的测定。LoWry法除使肽链中酪氨酸、氨酸和半胱氨酸等显外，还使双缩脲法中肽键的显效果更强烈，其显效果比单独使用酚试剂强3～15倍，约是双缩脲法的100倍。由于肽键显效果增强，从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏差。LoWry法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理(如加入少量的SDS)。
1.双缩脲法的原理双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在碱性溶液中可与铜离子产生紫红的络合物，这一反应称为双缩脲反应。因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。
双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。且使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1～10Mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约0 5Mg以上。双缩脲法的缺点是灵敏度差、所需样品量大。干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如TrIs缓冲液，因为它们产生阳性呈反应，铜离子也容易被还原，有时出现红沉淀。
2.福林-酚法的原理 该方法是双缩脲法的发展，包括两步反应：
(1)在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质—铜络合物。
(2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(ＦolIn试剂)还原，混合物深蓝(磷钼蓝和磷钨蓝混合物)，颜深浅与蛋白质含量成正比。此方法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5～100μg蛋白质。ＦolIn试剂显反应由酪氨酸、氨酸、半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物，均有干扰作用。此方法的缺点是有蛋白质的特异性影响，即不同蛋白质因络氨酸、氨酸含量的不同而使显强度稍有不同，标准曲线也不是严格的直线形式。
【仪器与用具】
试管若干；刻度移液管0 5Ml 1支，1Ml 1支，10Ml 1支；定量加样器；圆底烧瓶；冷凝管1套(带橡胶管)；微量滴定管；小烧杯；微量进样器50μl 1支；721分光光度计；恒温水浴器；研钵；玻棒；离心机；离心管。
【试剂】
NA2WO4·2H2O；NA2MoO4·2H2O；85％H3PO4；浓HCl；罗志祥演过的电视剧LI2SO4·H2O；溴水；酚酞指示剂；NA2CO3；NAOH；CuSO4·5H2O；酒石酸钾钠；牛血清白蛋白。所用试剂均为化学纯或分析纯。
【方法】
1 试剂的配制
(1)碱性铜试剂(相当于双缩脲试剂)的制备首先配制A液：4％碳酸钠(NA2CO3)溶液与0 2Mol／L氢氧化钠(NAOH)溶液等比例混合(2％NA2CO3，0 1Mol NAOH)；B液：1％硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶液与2％酒石酸钾钠溶液等比例混合(0 5％CuSO4·5H2O，0.1％酒石酸钾钠)。在使用前将A液与B液按50∶1的比例混合即成。此为ＦolIn—酚试剂甲液，此试剂只能使用1天。
酚试剂(相当于ＦolIn试剂)的配备：称取钨酸钠(NA2WO4·2H2O)100g、钼酸钠(NA2MoO4·2H2O)25g，加蒸馏水700Ml溶解于1500Ml的圆底烧瓶中。之后加入85％的H3
PO450Ml，浓HCl 100Ml，安上回流装置爱之初体验(使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来)，使其慢慢沸腾10H。冷却后加入硫酸锂(LI2SO4·H2O)150g，水50Ml，溴水2～3滴，不用回流装置开口煮沸15Min，以释放出过量的溴。待冷却后稀释至1000Ml，并过滤入棕瓶中，密闭于冰箱中保存(冷却后溶液呈黄，倘若仍呈绿，须再滴加数滴液体溴，继续煮沸15Min)。使用时用标准NAOH溶液滴定，以酚酞作为指示剂，滴定终点由蓝变灰，滴定后算出酸的浓度。使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1Mol／L H＋酸，此为ＦolIn－酚试剂乙液(ＦolIn试剂)。
在测定时要注意，因为酚试剂仅在酸性条件下稳定，但此实验的反应只在PH值为10的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显程度减弱。
（2）标准蛋白质溶液的配制 称取25mg牛血清白蛋白，溶于100Ml蒸馏水中，使最终浓度为250μg／Ml。
2 标准曲线的绘制
（1）取7支试管，编号后，分别加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml标准蛋白质溶液，用蒸馏水补足1Ml，使每管含蛋白量分别为0μg、25μg、50μg、100μg、150μg、200μg、250μg(必要时可做重复)。
(2)在每支试管中用定量加样器加入5Ml甲液，混匀，于30℃下放置10Min。
(3)在每支试管中喷射加入0 5Ml乙液，立即振荡混匀，在30℃下保温30Min。
(4)准确到30Min后，以不加标准蛋白试管中的溶液为空白，在500nM下用1CM光径的比杯对系列标准蛋白溶液进行比，测定光密度值。
以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。
3 样品的测定
(1)样品的提取：称取鲜样0 5g，用5Ml蒸馏水或缓冲液研磨提取。
取1 0Ml(视蛋白质含量适当稀释)样液加入试管中，然后重复步骤2的(2)、(3)、(4)，以标准曲线中的0管为空白，测定吸光值。
(2)根据吸光值查标准曲线，求出比液中的蛋白质含量。
4 结果计算
样品中蛋白的含量(Mg／g)＝C×VTV1×FW×1000(2-1）
式中C:查标准曲线值(μg)；
VT:提取液总体积(Ml)；
ＦW:样品鲜重(g)；
V1:测定时加样量(Ml)。
【注意】
还原物质，其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。
方法二：考马斯亮蓝G－250染法
【原理】
考马斯亮蓝G－250(GooMAssIe BrIllIAnT Blue G－250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G－250在游离状态下呈红，在稀酸溶液中，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青，前者最大光吸收在465nM，后者在595nM。在一定蛋白质浓度范围内(1～100μg)，蛋白质与素结合物在595nM波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G－250结合在2Min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1H内保持稳定。该反应快速灵敏(灵敏度比ＦolIn－酚法还高4倍)、易于操作、干扰物质少(考马斯亮蓝G－250和蛋白质通过范德华力结合，受蛋白质的特异性影响较小，除组蛋白外，其他不同种类蛋白质染强度差异不大)，可测定微克级蛋白质含量，是一种比较好的蛋白质定量法。但此方法也存在其缺点，考马斯亮蓝在蛋白质含量很高时线性关系偏低，且不同来源蛋白质与素结合状况有差异。
【仪器与用具】
721分光光度计；10Ml量筒1个；研钵；烧杯；量瓶；移液管：1Ml 3支，0 1Ml 3支；10Ml具塞刻度试管14支。
【试剂】
标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白配成含蛋白质100μg／Ml的标准蛋白溶液;
90％乙醇；
85％磷酸(W／V)；
考马斯亮蓝G－250溶液：称取100μg考马斯亮蓝G－250，溶于50Ml 90％乙醇中，加入85％的磷酸100Ml，最后用蒸馏水定容到1000Ml，贮放在棕瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。
【方法】
1 标准曲线(蛋白质含量为0～100μg／Ml)的绘制 取6陕北民歌大全mp3支具塞试管，按表2－1数据配制含0～100μg／Ml的牛血清蛋白质液各1Ml。
表2－1不同蛋白质含量的牛血清蛋白质液配制表
管号123456蛋白质标准液（ml)00.200.400.600.801.00蒸馏水（ml)1.000.800.600.400.200蛋白质含量（μg）0在每支试管中加入5Ml考马斯亮蓝G－250
溶液，盖塞，反转混合数次，放置2Min后，用1CM光径比杯在595nM下比。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
2.样品提取液中蛋白质浓度的测定 吸取样品提取液1.0Ml(样品提取见LoWry法)，放入具塞试管中(每个样品设置两个重复)，加入5Ml考马斯亮蓝G－250溶液，充分混合，放置2Min后在595nM下比，记录吸光值，并通过标准曲线查得蛋白质含量。
3 结果计算
样品中蛋白质的含量(Mg／g)＝C×VTV1×FW×1000（2-2）
式中 C：查标准曲线值(μg)；
VT：提取液总体积(Ml)；
ＦW：样品鲜重(g)；
V1：测定时加样量(Ml)。
植物叶片可溶性蛋白含量测定
注意点： 1，考马斯亮蓝G-250所配溶液不稳定，所以每次实验都必须新配，且必须新做标准曲线； 2，考马斯亮蓝G-250配制完毕，如果发现溶液中有絮状沉淀，可以试用滤纸过滤后使用，如果实验中发现使用过滤后的考马斯亮蓝G-250溶液在与样品接触后短时间内便又发生絮凝，基本上推测该考马斯亮蓝G-250过期（比较容易出现）。 原理 植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。 考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0～100μg/ml），蛋白质－素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。 试剂 （1）牛血清白蛋白 配成100μg/ml； 哀悼歌曲 （2）考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液在常温下可放置一个月； （3）90%乙醇； （4）磷酸（85%，W/V）。 方法 林允儿素颜 1.标准曲线的绘制 （1）0～100μg/ml标准曲线的制作 取6支试管，按表28-1数据配制0～100μg/ml血清白蛋白液各1ml。准确吸取所配各管溶液0.1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2min后，在595nm下比，绘制标准曲线。 表28-1 配制0～100μg/ml血清白蛋白液
2.样品提取液中蛋白质浓度的测定 吸取样品提取液1ml（样品提取与SOD酶活测定时相同），放入具塞刻度试管中（设两个重复管），加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后在595nm下比，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。 3.结果计算 样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=(C*V/a)/W 式中 C－查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）； V－提取液总体积（ml）； a－测定所取提取液体积（ml）； W－取样量（g）。 | |||||||||||||||||||||
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