第27卷第6期2008年11月 食品与生物技术学报Journal of Food Science and Biotechnology Vol.27 No.6Nov. 2008
文章编号:167321689(2008)0620023206 收稿日期:2007210212.
基金项目：国家863计划项目(2007AA10Z300)；国家“十一五”科技支撑计划重点项目(2006BAD27B04)；无锡市
科技局社会发展项目(CS030011)；江南大学青年基金项目(2007L QN16)
作者简介：魏慧贤(19712)，女，山东淄博人，工学博士，讲师，主要从事食品化学的研究.Email :chunpu2006@hot 2
mail
和胰岛素包埋率的影响
魏慧贤1,2, 钟芳2, 麻建国2
(1.江南大学化学与材料工程学院，江苏无锡214122;2.江南大学食品学院，教育部食品科学
与安全重点实验室，江苏无锡214122)
摘 要：研究了用两步乳化法制备W/O/W 型复乳时，第二步乳化的乳化工艺参数对复乳的稳定性和药物包埋率的影响规律。以胰岛素为模型药物，用两步乳化法制备W/O/W 型复乳，用离心后的乳层保留率评价复乳的稳定性，用高效液相法测定胰岛素在复乳中的包埋率，用激光光散射法测定复乳的粒度分布。实验结果表明，随着第二步乳化过程中乳化强度的提高，复乳滴的粒径减小，复乳的离心稳定性提高而胰岛素包埋率降低。胰岛素包埋率与复乳的粒度分布的关系分为两个区域：当乳化强度较小时，复乳滴的粒径较大，比表面积较小，胰岛素包埋率与体积平均粒径成正比；当乳化强度增大时，复乳滴粒径减小，比表面积增大，胰岛素包埋率与比表面积成反比。在本研究中使胰岛素包埋率最高的第二步乳化过程工艺参数为:Vir Tishear 高速分散均质机分散速度2000r/min ，分散时间3min ，此工艺下胰岛素的包埋率达到55%。
关键词:W/O/W 型复乳；两步乳化法；乳化工艺参数；离心稳定性；胰岛素包埋率中图分类号:O 648.23文献标识码:A
Influences of Emulsifying Parameters on the Stability and Insulin
Encapsulation E ff iciency of W/O/W Multiple Emulsions
WEI Hui 2xian 1,2, ZHON G Fang 2, MA Jian 2guo 2
(1.School of Chemical &Material Engineering ,Jiangnan University ,Wuxi ,214122,China ;2.Key Laboratory of Food Science and Safety ,Ministry of Education ,Jiangnan University ,Wuxi ,214122,China )
Abstract :Influences of emulsifying parameters of t he second emulsifying procedure during t he p reparation of multiple emulsions (M Es )by two 2step emulsifying met hod were investigated wit h respect to multiple emulsions stability and insulin encap sulation efficiency (IEE ).Emulsion stabilities were characterized by cent rif ugal creaming ratio ,IEE were determined by HPL C met hod.Droplet size dist ribution were investigated by laser scattering technics.The result s shows t hat emulsifying parameters of t he second emulsifying procedure remarkably affected t he stability and IEE of M Es.St rong emulsifying parameters improve t he stability of M Es by decreasing droplet size of oily drop s ,but decrease IEE by increasing diff usion area and decreasing
diff usion lengt h.The best emulsifying parameters of t he second emulsifying step wit h respect to IEE were as follow :Vir Tishear emulsifying machine ,stirring rate :2000r/min ,stirring time :3min ,wit h an encap sulation efficiency of insulin 55%.
K ey w ords :W/O/W multiple emulsions ;two step emulsifying ;emulsifying parameters ;cent rif ugal creaming stability ;IEE (insulin encap sulation efficiency )
复乳，全称为“复合乳状液(double emulsions )”
或“多重乳状液(multiple emulsions )”，是将乳状液分散在另外一种连续相中得到的复合型乳剂[1-2]，有水/油/水(W/O/W )、油/水/油(O/W/O )、固/油/水(S/O/W )、水/固/水(W/S/W )等多种类型，以W/O/W 和O/W/O 两种类型最为常见[2-3]，一般通过两步乳化法制备[4-7]。在结构上复乳具有两膜三相的多重隔室结构(图1)。因为这种多重隔室结构有助于实现隔离、保护、持续释放、控制释放、靶向释放、掩藏风味等功能，所以在药剂学、食品、化妆品、乳胶漆、膜分离等许多领域有广阔的应用前景，尤其是在药剂学领域，将W/O/W 复乳体系应用于水溶物(疫苗、维生素、酶、荷尔蒙)的包埋和控制释放技术的研究非常活跃[8-10]
。
图1 W/O/W 型复乳结构示意图
Fig.1 Schem atic illustration of the structure of W/O/W
multiple emulsions
但是复乳本质上属于热力学不稳定的多相体系，倾向于以聚集、絮凝、相转变、相分离的形式发生结构的破坏，而所包埋的物质也倾向于在制备及储存过程中以非控制的形式进行释放，这两方面的缺陷限制了复乳的实际应用
[11-12]
。为了解决这两
方面的问题，国内外很多学者从不同的角度进行了很多研究工作[13-18]，如选用聚合性大分子乳化剂、巩固复合界面膜、优化油相组成、稳定内水相、改进制备工艺等。本研究中拟考察两步乳化法中第二步乳化过程的工艺参数对复乳的稳定性和药物包埋率的影响规律。两步乳化法指先将油溶性的非离子型乳化剂、内水相、油相混合制得W/O 初乳，再把初乳倒入水溶性的非离子型乳化剂的水溶液中乳化制得W/O/W 型复乳[19]。通常，第一步乳化
过程采用高强度的乳化条件以制备细腻稳定的初
乳，而第二步乳化过程应采用较为温和的乳化条件，以免初乳被过分打散而得不到复合乳液结构[2]。作者主要研究第二步乳化工艺参数对复乳稳定性和药物包埋率的影响规律，为W/O/W 型复乳的制备和
应用提供实践和理论依据。
1 材料与方法
1.1 复乳的制备
以液体石蜡作为油相，以聚合型大分子表面活性剂聚氧乙烯(30)二聚羟基硬脂酸脂(PEG -30Dipolyhydroxystearate ，商品名Arlacel P135，美国ICI 公司提供)作为亲脂性乳化剂，以Tween 80和Span 80的质量比1∶1的混合物作为亲水性乳化
剂制备复乳；丙酮和无水乙醇质量比1∶1的混合物用于复乳的破乳，以上试剂均为分析纯，除Arla 2cel P135外都购买自国药集团化学试剂有限公司；胰岛素注射液,40U/mL ，批号0605012，江苏万邦生化医药股份有限公司提供；乙腈，三氟乙酸(TFA )，谱纯，国药集团化学试剂有限公司提供。
将亲油性乳化剂(10%质量分数的Arlacel P135)在50℃条件下溶解在液体石蜡中，胰岛素注射液稀释1倍的水溶液作为内水相，内水相与油相的质量比为1∶1，在室温下，在Ult ra 2Turrax T25高速分散乳化器(I KA 2Labortechnik ,Germany )上以9500r/min 的速度边搅拌油相边将内水相缓慢加入，分散时间6min ，制备初乳；然后将10%质量分数的亲水性乳化剂(Tween 80和Span 80的质量比1∶1的混合物)加入外水相，在Vir Tishear 高速分散均质机(Virtis Campany ,U S )上将初乳分散在外水相中，分散
速度取2000、4000、6000r/min 3个水平，分散时间分别取3、5、8min 3个水平，按照正交表L 9(34)安排实验，制备9个样品，分别测定其各项性质，考察复乳的制备工艺参数对复乳的离心稳定性和药物包埋率的影响。1.2 复乳性质的测定1.2.1 复乳的粒度分布 复乳的粒径分布用Mi 2
42食 品 与 生 物 技 术 学 报 第27卷
crotrac Flex激光光散射粒度测定仪(Microt rac Inc.U S)测定，将样品池清洗干净后滴入2～3滴复乳样品，使吸光率在20%～80%范围内，连续相折光指数取1.333，分散相折光指数为1.465，用S3000程序进行测定，可同时获得体积平均粒径、表面积平均粒径、数均粒径、比表面积、粒径分布等信息。
1.2.2 复乳的显微观察和显微相片的拍摄 取少量复乳置于载玻片上，盖上盖玻片，在Angel AQ-2010C高倍相差显微仪(镇江安琪精密仪器有限公司提供)上,40倍物镜下调节显微镜，观察复乳微观结构，并用显微仪自带照相机拍下复乳的显微照片。
1.2.3 复乳的离心稳定性 复乳的稳定性用离心分层后的乳层保留率表示。取少量样品置于刻度离心管中，在T G162WS台式高速离心机(0～12000r/min，长沙湘仪离心机仪器有限公司提供)中以800g的离心分离因数离心15min，读取离心管中的总液体体积及底部析出的水相的体积，用以下方程式(1)计算乳层保留率( )，作为离心稳定性的指标:
=V t-V w
V t
×100%(1)式中,V t为离心管中乳液的总体积,V w为底部析出的水相的体积。
1.2.4 高效液相法测定胰岛素在复乳中的包埋率 样品的准备：用去离子水将复乳稀释5倍，以500g的分离因数离心30min使之分层，准确移取1mL上层析出的乳层，加入1mL破乳剂(丙酮与乙醇体积比1∶1的混合液)，振摇10min破乳，以3000g的分离因数离心25min，取水相在高效液相谱仪(美国安捷伦Agilent公司提供)上测定胰岛素的浓度。
高效液相条件：流动相A为质量分数30%的乙腈的质量分数0105%TFA溶液，流动相B为质量分数50%的乙腈的质量分数0105%TFA溶液，谱柱为Zorbax SB200!C18谱柱,416mm×250 mm(美国Zorbax公司提供)。梯度洗脱条件:0～15min,100%A→100%B;15～18min,100%B→100%A;18～25min,100%A。体积流量1mL/ min，柱温30℃，进样量20μL。检测：紫外,220 nm；以胰岛素注射液原液为标样，样品中胰岛素浓度的计算为:
C样品=A样品
A标样
×40(2)
式中,C样品为样品的浓度,A样品为样品的峰面积,
A标样为标样的峰面积,40为标样的浓度，单位
U/mL。胰岛素包埋率的计算公式为:
φ=C样品×3
20
×100%(3)
式中,φ为胰岛素的包埋率,3是指内水相被稀释了
3倍，因为按照复乳的配方，内水相在乳层中的体积
分数为50%，将乳层进行破乳时，乳层与破乳剂的
体积比为1∶1，假定破乳后内水相与破乳剂完全混
溶，则内水相被稀释3倍。20是指理论上胰岛素全
部包封时内水相的浓度20U/mL。
2 结果与讨论
2.1 第二步乳化工艺参数对复乳粒度分布的影响
一般的，乳化过程的乳化强度对分散相液滴的
粒径有重要影响，乳化过程的本质是依靠剪切所产
生的粘性力克服Laplace压力梯度，以使分散相发
生变形并破裂形成液滴[20]，粘性应力的值等于剪切
复仇者联盟结尾彩蛋所产生的速度梯度与连续相的黏度的乘积(式4),tvb刘俐
F=ηc
d u
d x
(4)
式中,ηc为连续相的黏度,(d u/d x)为剪切所产生的
速度梯度，数值上与分散速度成正比，所以随着分
散速度的增大，粘性应力增大，分散相液滴粒径将
减小，本实验的结果验证了这一理论。由图2和图
3可见，随着第二步乳化过程乳化强度的提高，复乳
滴的体积平均粒径减小，平均比表面积增大。当乳
化强度从最小的2000r/min,3min增加到最强的
6000r/min,9min时，复乳滴的体积平均粒径从
615μm降低到0137μm，平均比表面积从1144m2/
m3增大到3817m2/m3。
图2 复乳制备时的分散速度和分散时间对复乳滴的
体积平均粒径的影响
Fig.2 I nfluences of stirring rate and stirring time of the
second emulsifying procedure on the mean size of
the oily droplets of the multiple emulsions
52
第6期魏慧贤等：第二步乳化工艺参数对W/O/W型复乳稳定性和胰岛素包埋率的影响
图3 复乳制备时的分散速度和分散时间对复乳滴的平均比表面积的影响
Fig.3 I nfluences of stirring rate and stirring time of the second emulsifying procedure on the mean surface
of the oily droplets of the multiple emulsions
分散时间的影响同样如此，在本研究中所使用的最高分散速度6000r/min的搅拌速度下，乳化时间从3min增加到5min，所制备的复乳的体积平均粒径从51315μm降低到21489μm，平均比表面积从114m2/m3增加到14174m2/m3；当乳化时间继续增加到8min，所制备的复乳的体积平均粒径从21489μm降低到01513μm，而复乳滴的平均比表面积从14174m2/m3增加到38172m2/m3；说明随着第二步乳化时间的增加，乳化进行得越来越充分，分散液滴的粒径越来越小。在最强的乳化条件(6000r/min,8min)下得到的复乳的体积平均粒径01513μm已经接近简单乳状液的粒径范畴，说明复乳滴有被过分打散的趋势(图4)。图4中的3张显微图片分别是本研究中最弱乳化条件(2000 r/min,3min)、中等乳化条件(4000r/min,5min)、最强乳化条件(6000r/min,8min)下得到的复乳的显微照片。由图可知，最强乳化条件得到的复乳滴粒径最小，直观地表明了第二步乳化工艺强度对复乳滴粒径的影响。
图4 第二步乳化时的分散速度和分散时间对复乳滴粒径的影响的显微图片(×40倍物镜) Fig.4 Microscopy of W/O/W multiple emulsions prepared at at different stirring rate and stirring time飞跃的心
2.2 第二步乳化工艺参数对复乳离心稳定性的影响
第二步乳化工艺参数对复乳离心稳定性的影
响见图5。由图可见，随着乳化速度和乳化时间的
增大，复乳的离心稳定性提高，这是由随乳化强度
提高复乳滴的粒径减小决定的。根据多相体系中
的分散相液滴上浮或下沉的沉降速率理论，分散相
液滴的上浮或下沉速度与液滴直径的平方根成正
比(式6)。[21]:
u t=4gd p(ρ-ρp)
3ρC D
(6)
www.vvvdj式中g为重力加速度,d p为分散相粒子粒径,ρ为连续相密度,ρp为分散相液滴的密度,C D为分散相与连续相相对运动的曳力系数，显然分散相粒子粒径的降低使体系的离心稳定性提高。将复乳的离心稳定性对其体积平均粒径的平方根作图(图6)，可见二者成反比，相关系数达到0
19155。这说明复乳制备时的乳化强度通过影响复乳滴的平均粒径而影响复乳的离心稳定性。使复乳的离心稳定性最好的工艺条件是:6000r/min,8min。
图5 第二步乳化工艺参数对复乳的离心稳定性的影响
Fig.5 I nfluences of stirring rate and stirring time of the second emulsifying procedure on stability of the
multiple emulsions
62食 品 与 生 物 技 术 学 报 第27卷
图6 复乳滴的体积平均粒径与其离心稳定性的关系
Fig.6 R elationship betw een mean size of oily droplet of
the multiple emulsion and it ’s stability
2.3 第二步乳化工艺参数对胰岛素包埋率的影响
复乳的乳化工艺参数对复乳胰岛素包埋率的影响规律与对其稳定性的影响规律正相反。如图7所示趋势可知，随分散速度和分散时间的增加，复乳的胰岛素包埋率显著降低，当乳化强度从最小的2000r/min ,3min 增加到最强的6000r/min ,9min 时，复乳对胰岛素的包埋率从55%低到10%
。
图7 第二步乳化工艺参数对复乳的胰岛素包埋率的
影响
Fig.7 I nfluences of stirring rate and stirring time of the
second emulsifying procedure on IEE of multiple emulsions
如前所述，乳化强度的提高会导致复乳滴的粒径
减小，比表面积增加。在将初乳进行二次乳化形成复乳滴的过程中，初乳相被逐步剪切成小的分散油滴，在此过程中，只有处在初乳相内部的内水滴中的胰岛素才有可能被包埋在油滴中，而被剪切处的内水滴将被打破，与外水相合并，其所溶解的胰岛素便随之进入外水相，不能被包埋。所以，第二步的乳化强度越大，形成的复乳滴的粒径越小，所形成的第二界面越大(平均比表面积越大)，复乳的包埋率越低，这一规律在乳化强度提高，复乳滴的比表面积超过10m 2/m 3以后表现得很显著(图8)。这一区域内复乳的包
埋率与其比表面积成明显的反比关系，相关系数达到019459，而在比表面积小于10m 2/m 3的范围内，复
乳的包埋率与其比表面积的相关系数只有013349。
这是由于在此范围内，胰岛素的包埋率除了受比表面积的影响外，还主要受到包埋在复乳滴内部的内水滴向外水相的迁移释放速度的影响。已发表的文献认为，包埋在内水相中的活性物质可能通过分子扩散、胶束扩散以及整个内水滴向外表面的转移并破裂等几种途径转移到外水相[22224]，而这几种途径的速度都与复乳滴的大小有关。复乳滴越大，几种途径的转移所需要通过的距离越长，则内部的包埋物的释放越慢。所以，当乳化强度较小造成复乳滴的体积平均粒径较大时，活性物质的包埋率与比表面积的关系的显著性降低，而与体积平均粒径的相关性增大。将此区域内的胰岛素包埋率与体积平均粒径的关系做图(图9)，可见，在此区域内，胰岛素包埋率与体积平均粒径成正比，相关系数达到018905，这说明复乳的胰岛素包埋率与其比表面积的关系分为两个区域的论断是
正确的。
图8 复乳的胰岛素包埋率与其比表面积的关系分为
两个区域
Fig.8 R elationship betw een the drug encapsulation eff i 2
ciency of multiple emulsion and its mean surface is different when the mean size of the oily drop 2lets is
different
图9 复乳滴的体积较大时，复乳的胰岛素包埋率与其
体积平均粒径成正比
Fig.9 Direct ratio betw een drug encapsulation eff iciency
and mean size of oily droplets of multiple emul 2sion when the oily droplet are relatively big
7
2 第6期魏慧贤等：第二步乳化工艺参数对W/O/W 型复乳稳定性和胰岛素包埋率的影响
4 结 语
研究了两步乳化法制备复乳的工艺中第二步乳化工艺参数对复乳的稳定性和药物包埋能力的影响，结果表明，在相同的配方和初乳制备工艺条件下，第二步乳化强度越大，复乳滴的体积平均粒径越小，平均比表面积越大，复乳的离心稳定性提高，但是胰岛素的包埋率降低。具体说来，胰岛素包埋率和体积平均粒径的关系又分为两个区域：当乳化强度较小时，复乳滴的体积较大，内部包埋药物要转移
到外水相所要经过的距离增长，药物包埋率与粒径成正比；当乳化强度较大时，复乳滴粒径减小，比表面积增大，界面处内水滴的破裂成为影响胰岛素包埋率的主要因素，药物包埋率与比表面积成反比。本研究结果显示，复乳制备工艺对复乳的离心稳定性和药物包埋率的影响是相反的，要想同时提高药物包埋率和离心稳定性，单从工艺角度来考虑是不够的，需要进行新的探索，如在外水相黏度的改进、界面膜的强化、内水相的固化等方面进行探索。
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(责任编辑：秦和平) 82食 品 与 生 物 技 术 学 报 第27卷
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