论著
文章编号：１０００ ５４０４（２０１３）０１ ００３８ ０４
ＲＯＣＫ Ⅰ
７１００３２西安，第四军医大学西京医院药剂科２）
［摘要］ 目的 观察ＲＯＣＫ Ⅰ选择性抑制剂Ｙ ２７６３２对体外培养的人眼Ｔｅｎｏｎ囊成纤维细胞（ｏｃｕｌａｒＴｅｎｏｎｃａｐｓｕｌｅｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ＯＴＦｓ）增殖、凋亡和黏附性的影响。方法 体外培养的第４～６代ＯＴＦｓ经溶血磷脂酸（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃａｃｉｄ，ＬＰＡ）诱导后，不同浓度Ｙ ２７６３２处理，采用ＭＴＴ测定细胞增殖抑制率和细胞黏附抑制率，未经ＬＰＡ诱导ＯＴＦｓ细胞同时采用ＡｎｎｅｘｉｎＶ ＦＩＴＣ／ＰＩ双标记流式细胞术测定细胞凋亡率，以及细胞平板克隆增殖实验测定不同浓度Ｙ ２７６３２组ＯＴＦｓ细胞增殖克隆形成率。结果 ６、３０、１５０、７５０μｍｏｌ／ＬＹ ２７６３２各组经ＬＰＡ诱导的ＯＴＦｓ细胞增
殖抑制Ｄ（４９０）与ＬＰＡ组比较，差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１），ＯＴＦｓ细胞黏附抑制Ｄ（４９０）与ＬＰＡ组比较，同样具有统计学差异（Ｐ＜０ ０５，Ｐ＜０．０１）。随着Ｙ ２７６３２浓度增加，细胞凋亡率相应增加。未经ＬＰＡ诱导的ＯＴＦｓ细胞克隆形成率随着Ｙ２７６３２浓度的增高而降低。结论 Ｙ ２７６３２有效抑制ＬＰＡ诱导的ＯＴＦｓ增殖和细胞间黏附，诱导细胞早期凋亡。 ［关键词］ Ｙ ２７６３２；人Ｔｅｎｏｎ囊成纤维细胞；增殖；凋亡；黏附性 ［中图法分类号］ Ｒ３２２．９１；Ｒ３２９．２５；Ｒ９８８．１
［文献标志码］ Ａ
［基金项目］ 陕西省科技攻关项目（２０１１ Ｋ１４ ０２ ０３）［通信作者］ 孙乃学，Ｅ ｍａｉｌ：ｎｘｓｕｎ＿ｘｊｕ＠１２６．ｃｏｍ
［优先出版］ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／５１．１０９５．Ｒ．２０１２１１０１．０９２３．００４．
ｈｔｍｌ（２０１２ １１ ０１）ＥｆｆｅｃｔｏｆＹ ２７６３２，ａｓｅｌｅｃｔｉｖｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆＲＯＣＫ Ｉ，ｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄ
ａｄｈｅｓｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｏｃｕｌａｒＴｅｎｏｎ’ｓｃａｐｓｕｌａｒｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ
ＺｈａｎｇＸｉａｏｈｕｉ１，ＳｕｎＮａｉｘｕｅ１，ＦｅｎｇＺｈａｏｈｕｉ１，ＷａｎｇＣｈａｏ２，ＺｈａｎｇＹｉ１，ＷａｎｇＪｉａｎｍｉｎｇ１（１ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，
ＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌ，ＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅｏｆＸｉ’ａｎＪｉａｏｔｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ，ＳｈａａｎｘｉＰｒｏｖｉｎｃｅ，７１０００４；２ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，
ＸｉｊｉｎｇＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｘｉ’ａｎ，ＳｈａａｎｘｉＰｒｏｖｉｎｃｅ，７１００３２，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＹ ２７６３２，ａｓｅｌｅｃｔｉｖｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆＲＯＣＫ Ｉ，ｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄａｄｈｅｓｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｏｃｕｌａｒＴｅｎｏｎ’ｓｃａｐｓｕｌａｒｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（ＯＴＦｓ）ｉｎｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ａｆｔｅｒｉｎｄｕｃｅｄｂｙｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃａｃｉｄ（ＬＰＡ），ｔｈｅｆｏｕｒｔｈｔｏｓｉｘｔｈｐａｓｓａｇｅｓｏｆＯＴＦｓｗｅｒｅｅｘｐｏｓｅｄｔｏ６，３０，１５０ａｎｄ７５０μｍｏｌ／ＬｏｆＹ ２７６３２ｆｏｒ４８ｈ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ
ＭＴＴａｓｓａｙｗａｓａｐｐｌｉｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｒａｔｉｏｓｏｆｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｄｈｅｓｉｏｎ．ＯＴＦｓｗｉｔｈｏｕｔＬＰＡｉｎｄｕｃｔｉｏｎｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＹ ２７６３２，ａｎｄＡｎｎｅｘｉｎＶ ＦＩＴＣ／ＰＩｄｏｕｂｌｅｌａｂｅｌｉｎｇｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｗａｓａｐｐｌｉｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｔｉｃｒａｔｅ．Ｔｈｅｃｅｌｌｃｌｏｎｉｎｇｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｗａｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄｂｙｃｅｌｌｐｌａｔｅｃｌｏｎａｌｅｘｐａｎｓｉｏｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅｐｒｏ ｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎＤ（４９０）ａｎｄａｄｈｅｓｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎＤ（４９０）ｏｆＯＴＦｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＬＰＡ＋Ｙ ２７６３２ｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉ ｃａｎｔｌｙｇｒｅａｔｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｏｆＬＰＡ ｉｎｄｕｃｅｄＯＴＦｓ（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）．ＣｅｌｌａｐｏｐｔｏｔｉｃｒａｔｅｉｎｃｒｅａｓｅｄａｌｏｎｇｗｉｔｈｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｏｆＹ ２７６３２ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，ａｎｄｔｈｅｃｌｏｎｉｎｇｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＯＴＦｓｗｉｔｈｏｕｔＬＰＡｉｎｄｕｃｔｉｏｎｄｅｃｒｅａｓｅｄａｌｏｎｇｗｉｔｈｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｏｆＹ ２７６３２ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｙ ２７６３２ｃａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｉｎｈｉｂｉｔｂｏｔｈｐｒｏｌｉｆｅｒ ａｔｉｏｎａｎｄａｄｈｅｓｉｏｎｏｆＬＰＡ ｉｎｄｕｃｅｄＯＴＦｓ，ａｎｄｉｎｄｕｃｅｅａｒｌｙａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＯＴＦｓｗｉｔｈｏｕｔＬＰＡｉｎｄｕｃｔ
ｉｏｎ． ［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｙ ２７６３２；ｏｃｕｌａｒＴｅｎｏｎ’ｓｃａｐｓｕｌｅｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ；ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ａｄｈｅｓｉｏｎ
ＳｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙｔｈｅＴａｃｋｌｉｎｇＰｒｏｇｒａｍｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＳｈａａｎｘｉＰｒｏｖｉｎｃｅ（２０１１ Ｋ１４ ０２ ０３）．Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＳｕｎＮａｉｘｕｅ，Ｅ ｍａｉｌ：ｎｘｓｕｎ＿ｘｊｕ＠１２６．ｃｏｍ
结膜下Ｔｅｎｏｎ囊成纤维细胞是青光眼滤过术后滤过道瘢痕化的主要效应细胞。Ｒｈｏ小蛋白家族在调节
细胞骨架肌球蛋白、细胞点状黏附和细胞运动性起重
要作用［１］
。Ｒｈｏ相关卷曲螺旋形成蛋白激酶（Ｒｈｏ ａｓ ｓｏｃｉａｔｅｄｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌｋｉｎａｓｅ，ＲＯＣＫ）被认为是Ｒｈｏ蛋白的下游效应因子。在体外培养的成纤维细胞中，
ＲＯＣＫ激酶调节细胞点状黏附，压力纤维的形成［２］
。已知细胞的趋化、黏附与收缩都是通过微丝骨架的聚
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合与延伸来实现的。Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ信号通路通过多重磷酸化／脱磷酸化级联反应来调节细胞微丝骨架的聚合，控制细胞的多种生物学行为。本研究旨在通过ＲＯＣＫ Ⅰ选择性抑制剂Ｙ ２７６３２的应用，选择性阻断Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ信号通路，观察人Ｔｅｎｏｎ囊成纤维细胞细胞学行为，包括细胞增殖、凋亡和黏附性的变化。
１ 材料与方法
１．１ 试剂与仪器
ＤＭＥＭ培养液、胎牛血清（ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ，ＦＢＳ）和０ ２５％胰蛋白酶（华美生物工程公司），牛血清白蛋白（ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ，ＢＳＡ，美国Ｓｉ
ｇｍａ公司），ＲＰＭＩ１６４０培养基（美国Ｇｉｂｃｏ公司），噻唑蓝（ＭＴＴ，美国Ｓｉｇｍａ公司），Ｙ ２７６３２和溶血磷脂酸（Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃａｃｉｄ，ＬＰＡ，美国Ｓｉｇｍａ公司），ＡｎｎｅｘｉｎＶ ＦＩＴＣ／ＰＩ细胞凋亡检测试剂盒（美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
ＣＸ ＰＣ ２倒置相差显微镜（日本ＯＬＹＭＰＵＳ），ＤＧ３０２２Ａ型酶联免疫检测仪（南京华东电子），ＣＯ
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培养箱（美国Ｓｃｈｅｌｄｏｎ公司），超净工作台（苏州净化设备厂），细胞培养板（Ｃｏｓｔｅｒ公司），流式细胞仪（美国ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）。全自动细胞平板计数器（美国Ｂｉｏ Ｒａｄ）。
１．２ 方法
１．２．１ 体外培养细胞 人眼Ｔｅｎｏｎ囊组织来源于本院眼科白内障患者术中剪下的Ｔｅｎｏｎ囊组织，经由本院伦理委员会批准，并事先征得患者同意。采用组织块贴壁法进行人眼Ｔｅｎｏｎ囊成纤维细胞（ｏｃｕｌａｒＴｅｎｏｎｃａｐｓｕｌｅｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ＯＴＦｓ）培养。剪成
１ｍｍ×１ｍｍ的组织块，种植于细胞培养瓶内，加入含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养液培养、传代，倒置相差显微镜下观察细胞生长，取第４～６代对数生长期细胞用于实验。
１．２．２ 细胞增殖测定
１．２．２．１ ＭＴＴ比法检测Ｙ ２７６３２对ＯＴＦｓ细胞增殖的影响 ０．２５％胰蛋白酶消化细胞，２％ＦＢＳ培养液稀释成１．５×１０４／ｍＬ单细胞悬液，２００μＬ／孔接种于９６孔培养板，即每孔细胞数为０．３×１０４。
分７组（每组４个复孔）进行处理：对照组；ＤＭＳＯ组；ＬＰＡ（溶血磷脂酸）组；不同浓度６、３０、１５０和７５０μｍｏｌ／ＬＹ ２７６３２＋ＬＰＡ组。ＬＰＡ浓度均为１０μｍｏｌ／Ｌ。对照组加入等量２％ＦＢＳ＋ＤＭＥＭ培养液；ＬＰＡ＋Ｙ ２７６３２组：ＯＴＦｓ添加１０μｍｏｌ／ＬＬＰＡ孵育２４ｈ，然后添加不同浓度Ｙ ２７６３２。
７组细胞孵育４８ｈ后，ＭＴＴ比检测。按２０μＬ／孔加入ＭＴＴ工作液（５ｍｇ／ｍＬ），继续３７℃培养。４ｈ后弃去孔中液体，按１５０μＬ／孔加入二甲基亚砜（ＤＭＳＯ），微振荡器振荡１０ｍｉｎ，以ＤＭＳＯ为空白对照，酶联免疫检测仪比测定各孔于４９０ｎｍ波长的光密度值，同时计算不同浓度Ｙ ２７６３２处理组的细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率＝［１－处理组Ｄ（４９０）／ＬＰＡ组Ｄ（４９０）］×１００％。
１．２．２．２ 细胞平板克隆增殖实验 ０．２５％胰蛋白酶消化ＯＴＦｓ细胞，吹打成单个细胞，细胞计数。１０００／孔细胞接种于３．５ｃｍ培养皿，使细胞均匀分散，分别用０、６、３０、１５０、７５０μｍｏｌ／ＬＹ ２７６３２处理，３７℃，５％ＣＯ
２
孵箱培养。１０ｄ后，终止培养，弃上清，ＰＢＳ漂洗２次，甲醇固定１５ｓ，弃固定液，结晶紫（０．１％结晶紫，２０％甲醇溶于双蒸水）染３０ｓ，蒸馏水洗去染液，空气干燥，照相。全自动细胞平板计数器计数。根据各组ＯＴＦｓ细胞克隆数，计算克隆形成率（克隆形成率＝克隆数／接种细胞数１０００个×１００％）。
１．２．３ 细胞凋亡分析（双标记流式细胞术分析Ｙ ２７６３２对ＯＴＦｓ细胞凋亡的影响） 同上处理ＯＴＦｓ细胞，分５组，分别加入０、６、３０、１５０、７５０μｍｏｌ／ＬＹ ２７６３２，孵育４８ｈ，ＰＢＳ洗２次，７０％乙醇固定，－２０℃过夜，加入１００μＬＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ和ＦＩＴＣ标记的ＡｎｎｅｘｉｎＶ（２０μｇ／ｍＬ）１０ｍＬ，室温避光３０ｍｉｎ，再加入ＰＩ（５０μｇ／ｍＬ）５ｍＬ，避光反应５ｍｉｎ后，加入４００ｍＬＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ，立即在ＦＡＣＳｏｒｔ（ＢｅｅｔｏｎＤｉｃｋｓｏｎ，美国）下行流式细胞术定量检测，同时以不加ＡｎｎｅｘｉｎＶ ＦＩＴＣ及ＰＩ的细胞作为阴性对照。
１．２．４ 细胞黏附性测定（Ｙ ２７６３２对ＯＴＦｓ细胞黏附的影响） 包被基底膜：１０ｇ／Ｌ的小牛血清白蛋白（ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕ ｍｉｎ，ＢＳＡ）按１∶８稀释５０ｍｇ／Ｌ的ｍａｔｒｉｇｅｌ胶，５０μＬ／孔加入９６孔板，４℃过夜。水化基底膜：吸出培养板多余液体，每孔加入５０μＬ含１０ｇ／Ｌ的ＢＳＡ无血清培养液，３７℃孵育３０ｍｉｎ。０ ２５％胰蛋白酶消化ＯＴＦｓ细胞，调整细胞密度为１０５／ｍＬ，分别将１００μＬ细胞悬液接种于包被的９６孔板中。分７组（每组４个复孔）进行处理：空白对照组；ＤＭＳＯ组；ＬＰＡ组；６、３０、１５０和７５０μｍｏｌ／ＬＹ ２７６３２＋ＬＰＡ组。ＬＰＡ浓度均为１０μｍｏｌ／Ｌ。对照组加入等量２％ＦＢＳ＋ＤＭＥＭ培养液，ＬＰＡ＋Ｙ ２７６３２组：ＯＴＦｓ添加１０μｍｏｌ／ＬＬＰＡ孵育２４ｈ，然后添加Ｙ ２７６３２。７２ｈ后ＯＴＦｓ细胞先后加入１０ｇ／Ｌ的ＢＳＡ和１６４０培养液，分别在３７℃培养１ｈ。按２０μＬ／孔加入ＭＴＴ工作液（５ｍｇ／ｍＬ），继续３７℃培养。４ｈ后弃去孔中液体，按１５０μＬ／孔加入ＤＭＳＯ，微振荡器振荡１０ｍｉｎ，酶联免疫检测仪比测定各孔于４９０ｎｍ波长的光密度值。以ＬＰＡ组贴壁细胞Ｄ（４９０）值为参照，计算细胞贴壁率（细胞黏附率）。黏附抑制率＝［１－实验组细胞Ｄ（４９０）值／ＬＰＡ组细胞Ｄ（４９０）值］×１００％。
１．３ 统计学方法
数据以珋ｘ±ｓ表示，采用ＳＰＳＳ１９．０统计软件进行单因素方差分析，各组样本均值方差齐性检
验采用Ｌｅｖｅｎｅ检验，多组间Ｄ（４９０）值比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用ＬＳＤ ｔ检验。
２ 结果
２．１ 体外培养细胞
组织块贴壁后３～７ｄ细胞游出组织块，ＯＴＦｓ细胞贴壁生长，呈梭形，单层漩涡状、放射状排列。２０ｄ基本长满培养瓶壁，进行传代。传代后细胞２４ｈ贴壁，６～１０ｄ基本融合长满瓶底。传代４～６次后，细胞形态保持原状，第４代ＯＴＦｓ细胞呈扁平长梭形或分枝状单层排列（图１）。鼠抗人ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体染鉴定，染显示细胞质内与细胞长轴方向一致的丝网状、束状纤维（图２）。
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lonely akonＪ Ｔｈｉｒｄ Ｍｉｌ Ｍｅｄ Ｕｎｉｖ
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图１ 相差显微镜下观察第４代ＯＴＦｓ细胞 （×１００）
图２ ｖｉｍｅｎｔｉｎ染观察ＯＴＦｓ细胞 （×５００）
２．２ ＭＴＴ比法检测Ｙ ２７６３２对ＯＴＦｓ细胞增殖的影响
方差齐性检验Ｐ＝０．１５６，方差齐，可进行下列两两比较。总体样本Ｌｅｖｅｎｅ检验Ｐ＝０．００００，总体样本具有显著性差异。各组的Ｄ（４９０）值之间，对照组（１．２７８０±０．０４００）与ＤＭＳＯ组（１．１８６０±０．０５６０）比较，差异无统计学意义（Ｐ＝０．１０７）。对照组与Ｙ ２７６３２＋ＬＰＡ１５０μｍｏｌ／Ｌ组（１．１４８０±０．０７６０）比较，差异有统计学意义（Ｐ＝０．０２６）。ＤＭＳＯ组与Ｙ ２７６３２＋ＬＰＡ１５０μｍｏｌ／Ｌ组比较，差异无统计学意义（Ｐ＝０．４８８）。其余各组：ＬＰＡ组为（２．２４３０±０．０７９６），Ｙ ２７６３２＋ＬＰＡ６、３０、７５０μｍｏｌ／Ｌ组别为（２．０８２０±０．０５００）、（１．７０００±０．１４４０）、（０．３４８０±０．０３９７），组间及对照组比较，差异有统计学意义（Ｐ＜
０．０１）。与ＬＰＡ组比较，Ｙ ２７６３２＋ＬＰＡ６、３０、１５０、７５０μｍｏｌ／Ｌ组ＯＴＦｓ细胞增殖抑制率分别为（７．１６３５±１．５７５１）％、（２３．９３１４±８ ０６１１）％、（４８．７５４４±４．５７０５）％、（８４．５０４１±１．３４９７）％。２．３ Ｙ ２７６３２对ＯＴＦｓ细胞克隆增殖的影响
０、６、３０、１５０、７５０μｍｏｌ／ＬＹ ２７６３２组ＯＴＦｓ细胞克隆形成率分别是４４．８％、３５．７％、２２．９％、８．２％、０％。ＯＴＦｓ细胞克隆形成率随着Ｙ ２７６３２浓度的增高而降低。见图３。
Ａ：０μｍｏｌ／Ｌ；Ｂ：６μｍｏｌ／Ｌ；Ｃ：３０μｍｏｌ／Ｌ；Ｄ：１５０μｍｏｌ／ＬＹ ２７６３２图３ 不同浓度Ｙ ２７６３２对ＯＴＦｓ细胞克隆增殖的影响
２．４ 双标记流式细胞术分析Ｙ ２７６３２对ＯＴＦｓ细胞凋亡的影响
凋亡率方差齐性检验Ｐ＝０．０５３，方差齐，可进行下列两两比较。Ｌｅｖｅｎｅ检验总体样本Ｐ＝０．０３６，总体样本具有显著性差异。Ｙ ２７６３２＋ＬＰＡ０μｍｏｌ／Ｌ组与６μｍｏｌ／Ｌ组比较，差异无统计学意义（Ｐ＝０．１７３）。Ｙ ２７６３２＋ＬＰＡ０μｍｏｌ／Ｌ组与７５０μｍｏｌ／Ｌ组比较，差异无统计学意义（Ｐ＝０．０５）。Ｙ ２７６３２＋ＬＰＡ０μｍｏｌ／Ｌ组分别与３０、１５０μｍｏｌ／Ｌ组比较，差异有统计学意义（Ｐ＝０．０２８，０．００４）。随着Ｙ ２７
６３２浓度增加，凋亡细胞的比例相应增加。但是当Ｙ ２７６３２剂量达到７５０μｍｏｌ／Ｌ时，凋亡细胞的比例下降。见表１。
表１ 不同浓度Ｙ ２７６３２对ＨＴＦＳ凋亡的影响（ｎ＝３，％，珋ｘ±ｓ）
浓度凋亡细胞死亡细胞百分比活细胞百分比
０μｍｏｌ／Ｌ０．０２６７±０．０１１６０．５２００±０．５６９３９９．４３６７±０．５４０８６μｍｏｌ／Ｌ４．７８６７±４．７３１０６．０６６７±５．４５２３８９．１４３３±２．１３５０３０μｍｏｌ／Ｌ８．３３６０±３．７３８２ａ１０．０１３３±６．１７６７８１．５３３３±７．２１４５ｂ１５０μｍｏｌ／Ｌ１２．３１００±６．４７９０ｂ３６．５５６７±１２．１５９０ｂ５０．４２３３±８．０４６０ｂ７５０μｍｏｌ／Ｌ７．２４６７±０．８０８５ａ５５．０２６７±８．８２７８ｂ３７．３０６７±８．８２７８ｂａ：Ｐ＜０．０５，ｂ：Ｐ＜０．０１，与０μｍｏｌ／Ｌ比较
２．５ Ｙ ２７６３２对ＯＴＦｓ细胞黏附的影响
方差齐性检验Ｐ＝０．４００，方差齐，可进行下列两两比较。总体样本Ｌｅｖｅｎｅ检验Ｐ＝０．０００，总体样本具有显著性差异。各组的Ｄ（４９０）值之间，对照组（０．２８９０±０．０４５
１）与ＬＰＡ组（０．３３３７±０．０４７５）比较，差异无统计学意义（Ｐ＝０．１５８）。对照组与Ｙ ２７６３２＋ＬＰＡ６μｍｏｌ／Ｌ组（０．２５６７±０．０２４７）比较，差异无统计学意义（Ｐ＝０．３０３）。ＤＭＳＯ组（０．２２０５±０．０６０９）与Ｙ ２７６３２＋ＬＰＡ６μｍｏｌ／Ｌ组比较，差异无统计学意义（Ｐ＝０ ２４９）。ＤＭＳＯ组与Ｙ ２７６３２＋ＬＰＡ３０μｍｏｌ／Ｌ组（０．２１１６±０．０２４３）比较，差异无统计学意义（Ｐ＝０．７７２）。Ｙ ２７６３２＋ＬＰＡ６μｍｏｌ／Ｌ与３０μｍｏｌ／Ｌ组比较，差异无统计学意义（Ｐ＝０ １５４）。Ｙ ２７６３２＋ＬＰＡ１５０μｍｏｌ／Ｌ（０．１０３３±０．０６０６）与７５０μｍｏｌ／Ｌ组（０．０４１３±０．０１３８）比较，差异无统计学意义（Ｐ＝０ ０５５）。其余各组间比较，差异有统计学意义（Ｐ＜０ ０１）。与ＬＰＡ组比较，Ｙ ２７６３２＋ＬＰＡ６、３０、１５０、７５０μｍｏｌ／Ｌ组ＯＴＦｓ细胞黏附抑制率分别为（２２．５９±６．６０）％、（４１．３９±８ ３１）％、（６９．１６±１９．２１）％、（８７．６６±３．８２）％。
３ 讨论
青光眼术后滤过道瘢痕化是青光眼手术降眼压失败的主要原因之一。目前有研究表明滤过泡部位的结膜下瘢痕形成受ＯＴＦｓ细胞增生、迁移和收缩的影响［３］。青光眼手术后抗代谢药物的使用导致术后多个与滤过泡相关的并发症［４］。因此，我们需要不会造成广泛的组织损伤的抗瘢痕药物。在本研究中，一种特异性ＲＯＣＫ抑制剂Ｙ ２７６３２，在没有明显的细胞毒性时，可以诱导体外培养的ＯＴ
Ｆｓ发生多项变化，同时抑制ＯＴＦｓ增殖。
在增殖实验中，Ｙ ２７６３２可以抑制ＬＰＡ诱导的ＯＴＦｓ增殖，并且随着Ｙ ２７６３２浓度的增加，对ＯＴＦｓ细胞增殖抑制率逐渐增强。以ＬＰＡ组为对照，Ｙ ２７６３２＋ＬＰＡ６、３０、１５０、７５０μｍｏｌ／Ｌ各组ＯＴＦｓ细胞增殖抑制实验中Ｄ（４９０）与ＬＰＡ组比较，差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１），同时４组处理组组内两两比较，差异均有统计学意义（Ｐ＝０．０００）。ＬＰＡ存在于房水
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中，在青光眼滤过术术中和术后，由于血 房水屏障的破坏和循环流动的房水浸泡滤过道伤口，所以ＯＴＦｓ一直暴露在房水，血清中的ＬＰＡ和ＴＧＦ β中［８］。ＬＰＡ主要通过Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ信号通路调控黏着斑激酶的酪氨酸磷酸化和肌动蛋白细胞骨架的重组［５］，诱导剧烈的肌动蛋白纤维收缩和细胞的点状黏附，是强效的ＯＴＦｓ刺激因子之一［６－７］。根据报道，Ｙ ２７６３２可以抑制胶原格点模式中ＬＰＡ诱导的肌纤维母细胞的收缩，提示我们细胞的收缩有赖于Ｒｈｏ小蛋白的活化［９］。在细胞平板克隆增殖实验中，未经ＬＰＡ诱导的ＯＴＦｓ细胞克隆数和细胞克隆形成率均随着Ｙ２７６３２浓度的增高而降低，二者成负相关关系。与０μｍｏｌ／ＬＹ ２７６３２处理组相比，提高药物浓度对克隆形成还是相当有影响的，同时７５０μｍｏｌ／Ｌ浓度ＯＴＦｓ细胞克隆数为０，说明药物本身具有一定的毒性，组间差异较ＭＴＴ实验大，可能是由于无ＬＰＡ的作用。因此，对于无论有无ＬＰＡ诱导的ＯＴＦｓ细胞，Ｙ ２７６３２都具有明显的抑制作用。
在Ｙ ２７６３２对未经ＬＰＡ诱导的ＯＴＦｓ细胞凋亡实验中，随着Ｙ ２７６３２浓度增加，凋亡细胞的比例也相应增加，两者具有正相关性。但是Ｙ ２７６３２浓度增加后，坏死细胞的比例上升更快，当Ｙ ２７６３２浓度达到７５０μｍｏｌ／Ｌ时，坏死细胞过多造成凋亡细胞的比例下降。实验表明Ｙ ２７６３２可以诱导ＯＴＦｓ细胞的凋亡，使其活力下降，Ｙ ２７６３２浓度达到７５０μｍｏｌ／Ｌ时，开始出现细胞毒性。Ｒｈｏ小蛋白家族是细胞骨架肌动蛋白的重要调节因子，Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ信号转导参与众多与细胞骨架有关的细胞变化。有研究报道［１１］，ＲＯＣＫ特异性抑制剂Ｙ ２７６３２在多种细胞类型中，如上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和神经细胞，能抑制细胞周期从Ｇ
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期向Ｓ期过渡。
在黏附性实验中，Ｙ ２７６３２可明显抑制ＬＰＡ诱导的ＯＴＦｓ细胞之间的黏附性，并且随着Ｙ ２７６３２浓度的增高，ＯＴＦｓ细胞黏附抑制率增强。同样以ＬＰＡ组为对照，Ｙ ２７６３２＋ＬＰＡ６、３０、１５０、７５０μｍｏｌ／Ｌ４组ＯＴＦｓ细胞黏附抑制率分别为１２３．０７４６％、１３６．５８９８％、１６９．０４４１％、１８７．６２３６％。Ｙ ２７６３２浓度与ＯＴＦｓ细胞黏附抑制率表现出线性正相关关系。４组ＯＴＦｓ细胞黏附抑制实验中Ｄ（４９０）与ＬＰＡ组比较，差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。然而有实验表明Ｙ ２７６３２可增加ＯＴＦｓ和小梁网细胞细胞对细胞外基质的黏附性［１０］。众所周知，细胞骨架蛋白与整合素相互作用，调节细胞形状和细胞对细胞外基质的黏附性。因此，这种细胞之间的黏附性的下降和细胞对细胞外基质的黏附性的增加，可能与细胞形状的改变和细胞周边的点状黏附的再分布有关。上述实验提示Ｙ ２７６３２由于有效抑制ＬＰＡ诱导的ＯＴＦｓ增殖和ＯＴＦｓ细胞间的黏附而可能成为一种强效抗瘢痕药物。
本实验Ｙ ２７６３２作为一种选择性ＲＯＣＫ抑制剂，有效抑制ＬＰＡ诱导的ＯＴＦｓ增殖和ＯＴＦｓ细胞间的黏附，同时诱导ＯＴＦｓ细胞的早期凋亡，使其活力下降，并且明显抑制未经ＬＰＡ诱导的ＯＴＦｓ克隆增殖，并且没有明显细胞毒性。本研究从ＯＴＦｓ瘢痕化的角度出发，探讨了Ｙ ２７６３
２对ＯＴＦｓ细胞增殖、黏附和凋亡的影响，同时为阐明Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ信号转导在ＯＴＦｓ瘢痕化中的作用和发展一种新型抗瘢痕药物提供思路。
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（收稿：２０１２ ０８ ２０；修回：２０１２ １０ １４）
（编辑 张 维）
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第３５卷第１期２０１３年１月１５日
第 三 军 医 大 学 学 报
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