第47卷第4期2020年12月
V ol.47，No.4
December，2020茶叶通讯
Journal of Tea Communication
应激蛋白PERK及GRP78表达的实验研究
罗梓人1，贾 旭2，刘 红3 ，高 瑛3 ，买文丽3，刘行海3，刘 华3，郑 倩3*
（1. 川北医学院 药学院，四川 南充 637000；2. 川北医学院 药剂科，四川 南充 637000；
3. 川北医学院 生理学教研室，四川 南充 637000）
摘 要：为探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）对2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）大鼠肝脏细胞凋亡的作用及其机制与内质网应激蛋白PERK和GRP78表达的关系，采用注射小剂量链脲佐菌素联合喂养高脂饮食建立T2DM大鼠模型，成模后随机分为模型组（MOR组）
、EGCG1低剂量组和EGCG2高剂量组，同时设置正常对照组（NOR组）。EGCG1组与EGCG2组干预12周，检测各组大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、空腹胰岛素水平（fasting insulin，FINS）和计算胰岛素敏感指数（insulin sensitivity index，ISI），观察EGCG对大鼠糖代谢的影响；HE染和透射电镜分别观察肝细胞形态和超微结构变化，原位末端转移酶标记技术（TUNEL）方法检测各组大鼠肝细胞凋亡改变，免疫组化和实时荧光定量PCR分别检测肝脏PERK和GRP78蛋白的表达和mRNA水平。结果显示，比较MOR组，EGCG1组大鼠FBG显著降低（P < 0.01），EGCG2组大鼠FBG与FINS均显著降低（P < 0.01），ISI在高浓度EGCG组明显降低（P < 0.01）。HE染可见模型组肝脏结构存在明显病理损伤，EGCG1和EGCG2组均可观察到肝细胞结构的改善。透射电镜下模型组细胞核染质聚集，呈现细胞凋亡的改变，不同浓度EGCG干预后肝细胞凋亡细胞减少。TUNEL法测定NOR组有较少细胞凋亡，MOR组AI明显高于NOR组（P < 0.01），EGCG1、EGCG2组与MOR组比较AI降低，差异有统计学意义（P < 0.05，P < 0.01）。免疫组化显示MOR组PERK和GRP78蛋白表达显著高于NOR组（P < 0.01），EGCG1与EGCG2组PERK和GRP78蛋白表达减少，低于模型组（P < 0.05，P < 0.01）。RT-PCR结果显示，MOR组大鼠肝脏内质网应激蛋白PERK和GRP78的mRNA水平明显高于NOR组（P < 0.01），与MOR组相比，不同浓度EGCG干预后肝脏细胞中PERK和GRP78的mRNA水平降低，EGCG1组P < 0.05，EGCG2组P < 0.01。表明EGCG可通过降低内质网应激蛋白PERK 和GRP78的表达，抑制肝脏细胞内质网应激水平，从而减轻2型糖尿病大鼠肝细胞凋亡的发生。
关键词：表没食子儿茶素没食子酸酯；2型糖尿病；内质网应激；肝脏细胞；凋亡
中图分类号：S571.1 文献标识码：A 文章编号：1009-525X（2020）04-665-674 Experimental Study on the Effect of Epigallocatechin Gallate on Hepatocyte Apoptosis and the Expression of Endoplasmic Reticulum Stress Protein
PERK and GRP78 in Type 2 Diabetic Rats
LUO Zi-ren1，XU Jia2，LIU Hong3，GAO Ying3，MAI Wen-li3，LIU Xing-hai3，LIU Hua3，ZHENG Qian3*（1. School of Pharmacy, North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, China; 2. Department of Pharmacy, North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, China; 3. Department of Pharmacology, North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, China）
Abstract：To explore the effect of epigallocatechin gallate (EGCG) on apoptosis of liver cells in type 2 diabetes mellitus (T2DM) rats and the relationship between its mechanism and the expression of endoplasmic reticulum stress proteins perk
收稿日期：2020-09-08 修订日期：2020-09-20
基金项目：四川省教育厅重点项目（17ZA0168、17ZA0167），南充市科技厅课题（18SXH20224、18SXHZ0293）
作者简介：罗梓人（1994-），男，四川内江人，在读硕士研究生，研究方向：糖尿病发病机制及防治。
*通讯作者：郑倩（1971-），女，重庆市人，教授，研究方向：糖尿病发病机制及防治。E-mail:159****************go!go!7188
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2型糖尿病及其并发症已成为世界范围内危害人类生命健康的重要疾病之一。据国际糖尿病协会报道，全球18岁至99岁的成年人中T2DM的数量为4.51亿，据估计到2045年这一数字将上升到6.93亿[1]；而我国糖尿病患者数量近30年来增加超过了15倍，已经成为世界上糖尿病人口最多的国家，其中成年人11.6%患有糖尿病，50.1%的人为2型糖尿病前期患者[2]，T2DM患者占全部糖尿病患者的95%以上。肝脏作为参与体内糖代谢的主要器官，糖尿病肝病已经成为T2DM的主要并发症之一，然而其发病机制不清楚。研究认为T2DM的代谢紊乱导致的高血糖、高血脂激活相关促凋亡基因，引起细胞凋亡，最终产生组织损伤和细胞死亡。内质网应激（endoplas mic reticulum stress，ERS）是近年来发现的介导细胞
凋亡的重要途径之一[3]，越来越多的实验研究证实ERS介导T2DM肝细胞凋亡，并促进T2DM的发生发展[4]。内质网作为负责蛋白质合成与翻译后修饰的细胞器，亦是多肽链正确折叠与装配的重要场所。当细胞受到多种因素刺激时，内质网囊腔内出现大量的未折叠蛋白和错误蛋白的聚集，诱发内质网应激的早期反应即未折叠蛋白质反应（unfolded protein response，UPR），UPR 是内质网应激的重要特征。UPR的信号途径主要由一个ER分子伴侣葡萄糖调节蛋白（glucose reguilated protein 78，GRP78）和3个ER应激感受蛋白介导，3个感受蛋白为RNA依赖的激酶样内质网激酶（PEK-like kinase，PERK）、激活转录因子（activating transcription factor-6，A TF6）和肌醇必需酶1（inositol—requiring enzyme 1，IRE-1）[5]。GRP78是促进蛋白质正确折叠的重要分子伴侣，其表达上调是ERS 的重要标志之一，发生 ERS时候，PERK与
and GRP78, T2DM rat model was established by injecting low-dose streptozotocin combined with a high-fat diet. The rats were randomly divided into model group (MOR group), EGCG1 low-dose group and EGCG2 high-dose group, and normal control group (NOR group) was set up. EGCG1 group and EGCG2 group were treated for 12 weeks, the fasting blood glucose (FBG) and fasting insulin (FINS) levels of rats of each group were measured,and insulin sensitivity index(ISI) was calculated, the effects of EGCG on glucose metabolism in rats were observed. HE staining and transmission electron microscopy were used to observe the morphological and ultrastructural changes of liver cells, In situ te
rminal transferase labeling (TUNEL) method was used to detect the changes of hepatocytes apoptosis. Immunohistochemistry and real-time fluorescent quantitative PCR were used to determine liver endoplasmic reticulum stress protein expression and mRNA level of PERK and GRP78. The results showed that compared with the MOR group, FBG of EGCG1 group was significantly reduced (P < 0.01), FBG and FINS of the EGCG2 group were significantly reduced (P < 0.01). ISI in high concentration EGCG group was decreased significantly (P<0.01).HE staining showed that the liver structure of model group had obvious pathological damage, and the improvement of hepatocyte structure could be observed in EGCE1 and EGCG2 groups. Under the transmission electron microscope, the chromatin in nucleus of model group was aggregated, and the apoptosis of hepatocytes decreased after different concentrations of EGCG. TUNEL method.The AI in the MOR group was significantly higher than that in the NOR group (P < 0.01). Compared with the MOR group, the AI of EGCG1 and EGCG2 group was lower than that in MOR group, and the difference was statistically significant (P < 0.05, P < 0.01) . Immunohistochemistry showed that the expression of PERK and GRP78 protein in MOR group was significantly higher than that in NOR group (P < 0.01), while the protein expression of PERK and GRP78 in EGCG1 and EGCG2 groups was decreased, which was lower than that in model group (P < 0.05, P < 0.01). The results of RT-PCR showed that the mRNA levels of PERK and GRP78 proteins in the MOR group were significantly higher than those in th
e NOR group (P < 0.01). Compared with MOR group, the mRNA levels of PERK and GRP78 in different concentrations of EGCG were significantly lower than those in MOR group (P < 0.05 in EGCG1 group, P < 0.01 in EGCG2 group).These results show that EGCG can inhibit the level of endoplasmic reticulum stress level by reducing the expression of PERK and GRP78, thereby reducing the occurrence of hepatocyte apoptosis in type 2 diabetic rats.
Key words：Epigallocatechin gallate, Type 2 diabetes, Endoplasmic reticulum stress, Liver cells, Apoptosis
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罗梓人等：EGCG 降低2型糖尿病大鼠肝细胞凋亡与 内质网应激蛋白PERK 及GRP78表达的实验研究
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GRP78解离，发生自身磷酸化；PERK 蛋白的表达也认为是ERS 的重要标志[6]。目前研究认为UPR 早期可提供保护性应激反应[7]，但是持续和剧烈的作用则通过激活JNK 、CHOP 和caspase-12三条内质网应激凋亡信号途径，诱发细胞凋亡[8]。因此，深入研究ERS 介导糖尿病肝细胞凋亡机制，寻T2DM 的药物靶点可达到和预防糖尿病肝病的作用。
表没食子儿茶素没食子酸酯（epigollateca- techin gallate ，EGCG ）是茶叶特有的儿茶素，是茶多酚的主体部分，EGCG 对癌症、肥胖、糖尿病、心血管疾病等具有预防和功效，实验证实EGCG 可以降低心肌细胞、神经细胞以及肾脏足细胞凋亡[9-10]，其机制与降低PERK 、GRP78和caspase-12等内质网应激标志蛋白有关[11-12]。我们前期工作发现EGCG 可降低IL-1β诱导的MIN6细胞凋亡[13]，并且观察到2型糖尿病大鼠胰岛细胞内质网应激蛋白CHOP 与JUN 表达增加[14-15]，但关于EGCG 对糖尿病大鼠肝脏细胞凋亡的影响以及与内质网应激蛋白GRP78和PERK 的关系研究甚少。本实验复制2型糖尿病大鼠模型，通过EGCG 干预观察其对T2DM 大鼠肝脏凋亡的影响，并在此基础上进一步探讨与内质网应激蛋白PERK 与GRP78的关系，期待通过探究减轻内质网应激致细胞凋亡途径，为临床糖尿病及其并发症提供新的思路，同时为中药的临床开发提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 药物与试剂
EGCG （北京索莱宝，批号：SE8120），链脲佐菌素（Streptozotocin ，STZ ）为Sigma 公司产品（批号：CV900890）, 血糖测定仪为长沙三诺科技公司产品，胰岛素检测试剂盒为北方生物技术研究所产品，原位细胞凋亡试剂盒购自美国ROCHE 公司，抗大鼠多克隆抗体GRP78和PERK 购自博奥森（货号：4999R ，3016R ）。
1.2 动物建模与分组1.
2.1 动物建模
参照本实验室既往方法复制T2DM 大鼠模型[14-15]，清洁级雄性Wistar 大鼠，重量180~200 g 。4周高能饲料+STZ （25 mg ·kg -1）+4周高能饲料，第8周末检测大鼠FBG 与FINS 水平，计算胰岛素敏感指数（insulin sensitivity index ，ISI ）=ln （FBG*FINS ），以FBG ≥7.8 mmol ·L -1及同时伴有ISI 增加的大鼠作为T2DM 模型。1.2.2 分组
32只大鼠随机分为四组（每组n=8）：正常对照组（NOR 组）、模型对照组（MOR 组）、EGCG 低剂量干预组（EGCG 1组，10 mg ·kg -1· d -1）和EGCG 高剂量干预组（EGCG 2组，50 mg ·kg -1·d -1），对照组每次给予等量生理盐水处理。饲养期间定期检测动物FBG 和FINS 。EGCG 干预12周后，NOR 存活8只，MOR 组存活7只，EGCG 1组存活7只，EGCG 2组存活8只，末次给药后大鼠禁食不禁水12 h ，心脏穿刺采血制备血浆和血清标本并于-70 ℃保存待测；断髓处死动物，迅速摘取每组动物肝脏组织，除留取部分组织做形态学检测和免疫组化外，其余组织冻存于液氮中。1.3 血糖代谢功能检测
使用ELISA 试剂盒和全自动生化分析仪检测各组的空腹血糖（FBG ）、空腹胰岛素（FINS ）并计算胰岛素敏感指数（ISI ）检测结果。1.4 肝脏组织苏木精-伊红（HE ）染
新鲜肝脏组织于4%多聚甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，经HE 染后，中性树胶封片，光镜下观察肝脏结构。1.5 电镜检测肝细胞超微结构变化
取1×1×1新鲜肝脏组织为电镜标本，置于2.5%的戊二醛溶液中固定，经固定、梯度脱水、包埋、切片和双重染，透射电镜下观察并摄片。1.6 TUNEL 法检测肝细胞凋亡
应用原位末端标记法（TUNEL 法）进行检测。石蜡切片常规脱蜡至水，用蛋白酶K 室温孵育15~30 min 后，TUNEL 反应混合溶液50 μL 、37℃孵育60 min ，然后加入50 μL 转化剂POD 37℃孵育30 min ，再加入DAB 底物溶液显，苏木素复染细胞核并封片，最后在光学显
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微镜下观察，细胞核呈棕黄为凋亡细胞。用
凋亡指数（apoptotic index，AI）表示细胞凋亡
情况，即在高倍视野（×400）下，每只大鼠肝
脏切片共计数5个高倍视野，分别计数凋亡细
胞数量和总细胞数量，公式为：AI=（肝细胞凋
亡数/肝细胞总数）×100%。
1.7 免疫组化检测肝脏组织GRP78和PERK蛋
白的表达
新鲜肝脏组织以PBS液冲洗后用4%多
聚甲醛固定和石蜡包埋，再经过切片、脱蜡、
修复、封闭、滴加一抗和二抗、显、复染和
封片等处理。细胞浆呈棕黄显者为表达阳
性。采用评分法对结果进行分析，评分标准：
IHS=A×B，A为阳性细胞数分级0%~1%=0、
1%~10%=1、10%~50%=2、50%~80%=3、
80%~100%=4；B为阳性细胞显强度分级0（阴
性）、1（弱阳性）、2（阳性）、3（强阳性）。
1.8 肝脏组织GRP78和PERK的mRNA表达检
测
实时定量PCR（RT-PCR）方法检测。提
取总RNA，总RNA纯度鉴定，逆转录，反应
条件：37℃孵育50 min，70℃保温10 min，
反应得到的cDNA放置-20℃保存。两步法扩
增，扩增程序为：95℃10 min，（95℃15 sec，
60℃60 sec）×45个循环。Real Time反应体系
为：2×UltraSYBR Mixture 10 μL，上、下游引
物（10 μM）各0.4 μL，模板 2 μL，反应体系为
20 μL。根据Real Time PCR原始检测结果（表1），
按照2-△△ct相对定量计算分析，其中ct为循环数。
表1 GRP78、PERK和GAPDH的mRNA
引物序列和产物大小
Table 1 The primer sequence and product size of GRP78,
perk and GAPDH mRNA
引物名称引物序列（5'to3'）产物大小（bp）
GRP78-F AATGTCTTTGTTTGCCCACC
78 GRP78-R TCGTATGTCGCCTTCACTCC
PERK-F CTTATGCCAGACACACAGGACAA
48 PERK-R TCCATCTGAGTGCTGAATGGAATAC
GAPDH-F TGGAGTCTACTGGCGTCTT
138 GAPDH-R TGTCATATTTCTCGTGGTTCA 1.9 统计分析
采用SPSS 20.0软件进行数据分析，对各组数据进行正态性检验、方差分析，因各组数据均符合正态分布，所以均采用均数±标准差（±s）表示。多个样本均数比较，采用F检验，组间两两比较采用SNK-q法或Dunnet-t法检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 实验大鼠的一般症状和体征变化
T2DM模型大鼠具有糖尿病典型症状，毛发呈现紊乱无光泽的表现，大鼠易蜷体弓背，反应迟钝，大鼠体重随病程延长而呈下降趋势。不同浓度EGCG干预12周后，无论低浓度EGCG组还是高浓度EGCG组的大鼠糖尿病典型症状均有明显改善，大鼠毛发较为光泽，反应灵敏性增强，体重增加。
2.2 EGCG干预后各组大鼠FBG与FINS的变化
经EGCG干预12周后，MOR组与EGCG1组均死亡1只动物，原因可能为高血糖继发感染死亡。与NOR组比较，MOR组大鼠的FBG 与FINS均显著升高（P < 0.01），ISI明显升高（P < 0.01）。与MOR组比较，EGCG1组大鼠的FBG显著降低，EGCG2组大鼠的FBG与FINS均显著降低（P < 0.01）。与EGCG1组比较，EGCG2组大鼠的FBG与FINS均显著降低（P < 0.01）。ISI在高浓度组明显降低（P < 0.01）（表2）。
表2 不同浓度EGCG对大鼠FBG、FINS的影响Table 2 Effects of different concentrations of EGCG on
FBG and fins in rats
Group n FBG（mmol/L）ISI FINS（mIU/L）NOR8 6.24±0.62 4.22±0.2316.36±2.38 MOR720.53±3.66# 5.94±0.41#22.32±3.74# EGCG1715.78±2.62△ 5.43±0.3219.72±3.26 EGCG2813.06±2.34△* 4.35±0.24△*15.51±1.93△*注：NOR、MOR、EGCG1、EGCG2分别为正常对照组、糖尿病模型对照组、EGCG低剂量和高剂量干预组；#P<0.01, 与NOR组比较; △P<0.01，与MOR组比较;
*P<0.01，与EGCG1组比较，下同
2.3 EGCG处理对糖尿病大鼠肝脏结构的影响
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罗梓人等：EGCG 降低2型糖尿病大鼠肝细胞凋亡与 内质网应激蛋白PERK 及GRP78表达的实验研究
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如图1所示，HE 染可见MOR 组肝脏水肿样改变，肝细胞疏松，肝索排列紊乱，肝窦变窄，胞浆中有较多脂滴。NOR 组肝细胞内结构致密，边缘清楚，细胞核、胞质染均匀，未见充血及炎细胞浸润。EGCG 1组肝细胞排列比较整齐，边界比较清楚，细胞核、胞质染较为均匀，可见少量炎细胞浸润。EGCG 2组肝细胞板排列规整，细胞界限清楚，细胞核、胞质染均匀，未见炎细胞浸润。
如图2所示，透射电镜下NOR 组肝细胞形态结构正常，细胞核、核仁结构正常，肝细胞线粒体结构正常，胞浆可见丰富的线粒体、内质网、核糖体、糖原颗粒等。MOR 组可见两个细胞细胞核染质聚集，呈现明显细胞凋亡的改变，胞质细胞器结构消失。给予EGCG 后未见细胞核染质边聚现象，其中EGCG 1组可观察到肝细胞核轻度水肿，核中染质疏松，右侧可见水肿线粒体，大部分线粒体未见异常；EGCG 2肝细胞结构基本正常，与NOR 组超微结构相似。
2.4 EGCG 处理对肝细胞细胞凋亡的影响
图3和表3显示，TUNEL 法检测NOR 组有少量细胞凋亡，染不明显；MOR 组AI 明显高于NOR 组，
见大量棕细胞（P < 0.01），
凋亡率从12%增加到65%；EGCG 1、EGCG 2组与MOR 组比较，AI 降低，差异有统计学意义（P < 0.05，P < 0.01）。
表3 细胞凋亡指数（AI ）、PERK 蛋白、
GRP78蛋白水平的表达（x -±s ）Table 3 Apoptosis index (AI), PERK protein and GRP78
protein level expression
Group n AI （%）PERK （IHS ）GRP78(IHS)NOR 812±0.30.53±0.030.96±0.05MOR 765±1.2* 2.25±0.21* 2.56±0.23*EGCG 1741±0.2△ 1.56±0.28△ 1.31±0.08△△EGCG 2
8
24±0.5△△
0.95±0.08△△
1.06±0.05△△
注：AI ：肝细胞凋亡指数；IHS ：PERK 蛋白与GRP78蛋白表达的免疫组化评分
2.5 EGCG 处理对糖尿病大鼠肝脏PERK 蛋白表达的影响
由图4可见，免疫组化检测PERK 主要是在肝细胞的胞浆中表达，阳性细胞胞浆内可见棕黄颗粒。正常组表达较少，模型组PERK 蛋白表达显著高于正常组（P < 0.01），EGCG 1组与EGCG 2组PERK 蛋白表达显著低于模型组（P < 0.05，P < 0.01）（表3）。
2.6 EGCG 处理对糖尿病大鼠肝脏组织GRP78蛋白的表达
图1 光镜下观察2型糖尿病大鼠肝脏组织变化（×400）Figure 1 The changes of liver tissue in type 2 diabetic rats
were observed under light microscope （×400）
图2 电镜下观察2型糖尿病大鼠肝脏超微结构变化Figure 2 Ultrastructural changes of liver in type 2 diabetic
rats observed under electron microscope
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