Vol.34,No.5
May,2021
第34卷第5期
2021年5月
环 境 科 学 研 究
Research of Environmental Sciences
程智超1，杨立宾2，隋 心"，张 童1，王文浩1，尹伟平3，李国富3，宋福强1
1. 黑龙江大学生命科学学院，黑龙江省寒地生态修复与资源利用重点实验室，黑龙江哈尔滨150080
2. 黑龙江省科学院自然与生态研究所，黑龙江哈尔滨150040
3. 黑龙江中央站黑嘴松鸡国家级自然保护区服务中心，黑龙江嫩江161400
摘要：土壤微生物在森林生态系统中起着重要作用，因此研究不同森林类型下土壤微生物功能多样性具有重要意义.采用 Biolog-Eco 微平板法对位于黑龙江中央站黑嘴松鸡国家级自然保护区内的3种典型森林类型——白桦林、蒙古栎林、兴安落叶松
林下的土壤微生物功能多样性进行研究.结果表明：白桦林、蒙古栎林、兴安落叶松林土壤微生物AWCD(平均颜变化率)值、
Shannon-Wiener 指数和McIntosh 指数差异显著(P<0. 05). AWCD 随着培养时间的延长而逐渐增加，其中白桦林的AWCD 值最
高，而落叶松林的AWCD 值最低.主成分分析(PCA)结果表明,3种森林类型土壤微生物落代谢功能差异显著，主成分1和主 成分2分别可以解释方差变量的38. 81%和30. 30%.从碳源利用率来看，糖类和氨基酸类是影响3种森林类型土壤微生物功能 的主要碳源.典型相关分析(CCA)表明皿(SOC)(SOC 为土壤有机质),w(TN) (TN 为全氮)和pH 是影响土壤微生物功能多样
性的主要环境因子.研究显示，3种森林类型土壤微生物功能多样性和碳源利用方式均有显著差异，其主要受到土壤pH,
w(SOC)和“(TN)的影响.
关键词：土壤微生物；森林类型；碳源利用模式；Biolog-Eco 微平板技术中图分类号：X176
文章编号：1001-6929(2021)05-1177-10
文献标志码：A DOI ： 10. 13198/j. issn. 1001-6929. 2021. 01. 04
Soil Microbial Functional Diversity Responses to Different Revegetation Types in Heilongjiang Zhongyangzhan Black-Billed Capercaillie Nature Reserve
CHENG Zhichao 1 , YANG Libin 2, SUI Xin 1* * , ZHANG Tong 1 , WANG Wenhao 1 , YIN Weiping 3, LI Guofu 3, SONG Fuqiang 1
收稿日期：2020-05-05 修订日期：2020-12-31
作者简介：程智超(2000-)，男，黑龙江哈尔滨人,******************.
*责任作者，隋心(1982-)，男，黑龙江拜泉人，副教授，博士，硕导，主要从事生态学研究,xinsui_cool@ 126
基金项目：国家自然科学基金项目(No.32011530425)；黑龙江省自然科学基金项目(No.LH2020C088)；黑龙江大学杰出青年基金项目
( No.JCL202006)
Supported by National Natural Science Foundation of China ( No. 32011530425 ) ； Natural Science Foundation of Heilongjiang Province , China
(No.LH2020C088) ； Outstanding Youth Foundation of Heilongjiang University , China ( No.JCL202006)
1. Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Ecological Restoration and Resource Utilization for Cold Region , School of Life Sciences ,
Heilongjiang University , Harbin 150080, China
2. Institute of Nature and Ecology, Heilongjiang Academy of Sciences, Harbin 150040, China
3. Heilongjiang Zhongyangzhan Black-Billed Capercaillie Nature Reserve Administration Bureau , Nenjiang 161400, China
Abstract : Soil microbes play an important role in forest ecosystems. Therefore , it is of great significance to study the functional diversity of soil microbes under different forest vegetation types. In this study, the Biolog-Eco microplate method was used to study the soil microbial
functional diversity under three typical forest types-Betu/a p/atypAy/Za , ^uercas rnon,go//ca , and Larix gmelinii forests in Heilongjiang
Central Station Black-billed CapercaiHie National Nature Reserve. The results of the study showed that there were significant differences in soil microbial average well color development ( AWCD) values , Shannon-Wiener index and McIntosh index of Betula platyphylla , Quercus
mongoZica and Larix gmelinii soil ( P<0. 05). The AWCD gradually increased with the increase of cultivation time. The AWCD value of
Betula platyphylla forest was the highest , while the AWCD value of Larix gmelinii forest was the lowest. Principal component analysis
( PCA) showed that there were significant differences in soil microbes among the three forest types. Principal component 1 and principal
component 2 could explain 38. 81% and 30. 3% of the variance variables , respectively. From the perspective of carbon source utilization ,
1178环境科学研究第34卷
carbohydrates and amino acids were the main carbon sources that affect the soil microbial function of the three forest types.Canonical correlation analysis showed that organic carbon,total nitrogen and pH had significant impacts on microbial functional diversity.The results showed that the soil microbial functional diversity and carbon source utilization were significantly different between forest types,and were mainly affected by soil pH,w(SOC)and w(TN).下雨天了怎么办我好想你
Keywords：soil microorganisms；forest types；carbon source utilization patterns；Biolog-Eco microplate technology
在生态系统中，土壤微生物不仅参与养分循环和代谢过程［1］，而且直接影响地球生物化学循环［2］，在植物凋落物的分解中起着重要作用［3］，并通过改善土壤中的微生物含量间接影响植被的生长⑷.地质条件及植被等多种因素又对土壤微生物活性和多样性特征具有反馈作用［5-6］，随着植被组成的变化，土壤微生物生物量、活性、落结构以及多样性均呈现明显变化［7-10］.土壤微生物是森林生态系统重要的组成部分，在植被更新和演替过程中的作用尤其明显.土壤微生物落和功能的改变会影响地上植物组成和多样性.因此，研究植被组成变化与土壤微生物结构和功能的变化是目前生态学的研究热点，也是探究生态系统机制的重点研究领域.
森林生态系统是陆地生态系统的重要组成部分，在涵养水源、保育土壤、生态系统碳循环等方面具有重要作用［11］.森林土壤不但是动植物分解和循环的场所［12］，而且还是林木生存的物质基础［13］.植物对土壤环境的重要影响之一是改变土壤微生物落特征［14］.例如，孙雪等［15］对原始红松林退化演替后不同森林类型土壤微生物功能多样性的分析发现，处于不同森林植被演替阶段的土壤微生物碳源利用强度差异显著.而且，逢好胜等［16］对大兴安岭森林退化后不同植被类型土壤微生物功能多样性的研究发现, 3种植被退化类型的土壤微生物利用碳源存在较大差异.由此可以预见，原始森林发生退化后，不同森林类型阶段土壤微生物功能会发生明显改变.但是到目前为止，关于大小兴安岭交错区不同森林类型的土壤微生物功能多样性的变化尚不清楚•
黑龙江中央站黑嘴松鸡国家级自然保护区地处大小兴安岭过渡区，其森林类型具有大兴安岭和小兴安岭植被的特征•但是由于人类活动的影响，以兴安 落叶松为建种的原始林受到了大规模破坏，原始兴安落叶松林面积减少，随之而来的是次生演替以后出现的大量白桦林和蒙古栋林.森林类型的改变尤其是其建种的改变会导致生态系统功能发生变化，土壤生态系统受到地上植被组成的影响更为显著，但遗憾的是，目前关于植被变化或者说植被长期演替以后，土壤生态系统功能在森林交错区的研究还很少，对于森林交错区土壤微生物功能的特征还缺乏深入研究.鉴于此，该研究利用Biolog-Eco微平板技术，对黑龙江中央站黑嘴松鸡国家级自然保护区3种典型的森林类型(兴安落叶松林、白桦林、蒙古栋林)土壤微生物功能多样性的变化规律进行研究，旨在探讨寒温带森林生态系统发生次生演替后
土壤微生物落功能的差异和变化规律，以期为深入了解我国寒温带森林交错区森林生态系统功能和未来发展趋势提供依据和数据基础.
1材料与方法
1.1研究区域
试验地点位于黑龙江中央站黑嘴松鸡国家级自然保护区(126°00'E~126°45'E、48°30'N~48°50'N)，该保护区位于黑龙江省黑河市西南部，地处小兴安岭西南山麓与松嫩平原的过渡地带，总面积988.6km2.属温带大陆性季风气候区，冬季严寒漫长，夏季凉爽短促；年均气温-0.5弋，无霜期为121d，年均降雨量476.33mm，多年平均相对湿度69.2%.不同森林类型呈随机性分布，受周边环境影响，处于不同演替阶段的植物落均有分布，保护区是典型的高寒森林生态系统，区内有森林、灌丛、湿地和草甸.森林类型有针叶林、针阔混交林及阔叶林，保护区森林覆盖率高达82.4%［17］.主要植物有兴安落叶松(Zari”grnelinii)、紫椴(Tilia a肌ure兀sis)、钻天柳(CAosenia ar6uti/olia)、白桦(Betula platjpAylla)、黑桦(Betula /a局rica Pall.)、蒙古栋(Quercus mongolica)、山杨(Populus/a”i/iana)、稠李(Prunus pa/us)、大黄柳(Salix ra//eana)、东北赤杨(4lnus man/sAurica)等. 1.2研究方法
1.2.1样地设置和样品采集
于2019年7月进行样品采集，在保护区内选取白桦林、蒙古栋林、兴安落叶松林3种典型的森林类型，每种森林类型内设置3块样地，每个样地面积约400m2，每个样地内分别再设置3个10mX10m的小样方.
采用五点采样法采集表层(0~20cm)土壤，混合为1个土样.采集后的土壤样品首先剔除植物凋落物，然后过口径为2mm的土壤筛后放入自封袋中，
第5期程智超等：黑龙江中央站黑嘴松鸡国家级自然保护区不同森林类型土壤微生物功能多样性分析1179
置于4兀保温箱中保存，带回实验室.在实验室内将土壤样品分成2份，一份用于Biolog-Eco分析，一份室温风干后用于土壤理化性质测定.
1・2・2土壤理化因子测定
土壤pH采用水浸提电位法(水土比2.5：1)测定;/(SOC)和w(TN)采用元素分析仪(Elementar, Vario MAX CN,Germany)测定.
1・2・3土壤微生物落功能多样性的测定
首先将土壤样品在25°C的恒温箱活化24h，然后称取10.0g鲜土加入到无菌的200mL三角瓶中，再向三角瓶中加入100mL0.85%无菌氯化钠溶液，用密圭寸袋圭寸口，室温条件下,180r/min振荡30min，静置2min后依次稀释至10mL和1mL土壤悬浮液.用移液器吸取150|xL土壤悬浮液于Biolog-Eco 板中,25C下培养，每组试验均3次重复,590nm 处测定吸光度，每隔24h测定1次吸光度，连续测定10d[18-20].
1.3数据分析
痛哭的人吉他平均颜变化率(average well color development, AWCD)计算公式：
31
AWCD二丫(C,-A)/31(1)式中,C，为有碳源孔的吸光度值,R为对照孔的吸光度值,C,-R W0的孔在计算中记为0[21].
将培养216h的数据用于计算土壤微生物落功能多样性，计算公式：
Shannon-Wiener多样性指数[21]:
丹二p,X ln P,(2) Simpson优势度指数[21]:
31
D二1-工P,2(3)
，二1
McIntosh多样性指数[22]:
〃二*⑷
式中,P，为第，个孔的相对吸光度值与所有孔相对吸光度值总和的比值为第，孔的相对吸光度值[23].
数据分析采用Excel2003和SPSS17.0进行，采用SPSS17.0进行单因素方差分析，检测水平选择0.05水平，采用R语言进行热图、主成分分析(PCA)和典型相关分析(CCA)，数据包采用Vegan软件包. 2结果与讨论
2.1土壤理化性质
如表1所示，3种森林类型土壤pH、w(SOC)、w(TN)之间差异显著(P<0.05).其中，白桦林土壤pH最高，为6.03，落叶松最低，为4.39；白桦林的w(SOC)最高，为114.11g/kg，落叶松林最小，为95.04g/kg；白桦林w(TN)最高，为6.21g/kg，而落叶松林最小，为4.69g/kg；落叶松的C/N最高，为20.25，而白桦林C/N最小，为18.37.
表1土壤理化性质
Table1Soil chemical and physical properties
森林类型pH
w(SOC)/
(g/kg)
w(TN)/
(g/kg)
C/N 白桦林 6.03±0.60a114.11±9.99a 6.21±0.22a18.37±1.44a 蒙古栎林 5.34±0.10a100.97±0.76b 5.10±0.15b19.82±0.61a 落叶松林 4.39±0.04b95.04±3.97b 4.69±0.13c20.25±0.36a 注：数据为平均值土标准差5=3)，不同小写字母表示不同处理之间差异显著(P<0.05).
2.2土壤微生物AWCD的差异
AWCD表征微生物落碳源利用率，是土壤微生物落利用单一碳源能力的重要指标，反映了土壤微
生物活性和功能多样性[24-25].AWCD值越大，表明土壤微生物的密度和活性越高；AWCD值越小，微生物密度和活性越低.如图1所示,3种森林类型土壤微生物AWCD值的变化规律随着培养时间的延长而增加.培养24h后，土壤微生物适应了Biolog-Eco微孔板的基质环境，所有土壤微生物的AWCD值都急剧增加，表明所有土壤微生物落都能够在Biolog-Eco微孔板中代谢有机底物.在24〜216h的培养期间,AWCD值增速更快，并且在216h后趋于稳定，表明所有可培养的微生物都可以在稳定时期内稳定地使用碳源[26].
Fig.l AWCD of soil microbial community in
3different forest types within incubation
time
1180环境科学研究第34卷
在3种森林类型土壤中，阔叶林(白桦林和蒙古
栋林)土壤微生物的AWCD值均高于针叶林(兴安落
叶松林).216h后，白桦林和蒙古栋林土壤微生物的
AWCD值分别从0增至0.8和0.7，而落叶松林的
AWCD值增至0.6左右，表明阔叶林土壤微生物中活
性较高.然而，当落叶松林AWCD值趋于稳定时，其
AWCD值增至0.6左右，说明落叶松林的土壤微生物
活性最低.综上，不同森林类型下，土壤微生物的
AWCD值不同，土壤微生物落对碳源的利用能力
大小表现为白桦林〉蒙古栋林〉落叶松林.
2.3土壤微生物代谢多样性
从表2可以看出，3种森林类型土壤微生物的
Shannon-Wiener指数和McIntosh指数差异显著(P<
0.05)，但是Simpson指数差异不显著(P>0.05),
Shannon-Wiener指数呈白桦林>蒙古栋林>落叶松林
的规律，白桦林的Shannon-Wiener指数最高，为
3.05;McIntosh指数呈蒙古栋林〉白桦林〉落叶松林的
规律，蒙古栋林的Mclntosh指数最高，为9.28.
表2土壤微生物碳代谢功能多样性
Table2Soil microbial functional diversity of carbon utilization
森林类型AWCD值Shannon-Wiener
指数
Simpson
指数
McIntosh
指数
hey you白桦林 1.25±0.07a 3.24±0.05a0.957±0.002a9.06±0.97訪
蒙古栋林 1.20±0.08a 2.92±0.11b0.959±0.001a9.28±0.97b 落叶松林0.84±0.02b 2.65±0.09"0.953±0.000a8.34±0.88a
注：数据为平均值土标准差5=3)，不同小写字母表示不同处理之间差异显著(P<0.05).
2.4土壤微生物利用不同底物的能力
根据碳源生理生化特征,Biolog-Ec。的31个碳基质可以分为6类一糖类、氨基酸、酯、醇、胺和酸[27] (见表3).如图2所示：代谢指纹图谱中AWCD>2.0的碳源在白桦林土壤中有7种，包括i-赤藓糖醇、D-甘露醇、肝糖、0-甲基-D-葡萄糖苷、N-乙酰-D-葡萄糖胺、L-苏氨酸、吐温40，其中i-赤藓糖醇的AWCD 值最高，为2.7760；蒙古栋林土壤中有5种，包括L-天门冬酰胺、吐温40、L-丝氨酸、D-甘露醇、吐温80，其中L-天门冬酰胺的AWCD值最高，为3.0508；落叶松林土壤中有6种，包括D-甘露醇、0-甲基-D-葡萄糖苷、a-D-乳糖、吐温40、N-乙酰-D-葡萄糖胺、苯乙胺，其中D-甘露醇的AWCD值最高，为2.8324.
由图3可见，该研究中土壤微生物落代谢活性的热图结果可以分为4类：在I类中，落叶松林中2-羟基苯甲酸、D,L-a-磷酸甘油的AWCD值高于白桦林和蒙古栋林；在n类中，白桦林中D-甘露醇、0-甲基-D-葡萄糖苷、N-乙酰-D-葡萄糖胺的AWCD值显著高于落叶松林和蒙古栋林；在皿类中，落叶松林中D-木糖、a-D-乳糖的AWCD值显著高于白桦林和蒙古栋林；在W类中，蒙古栋林肝糖、i-赤藓糖醇的AWCD值显著小于白桦林和落叶松林.这表明不同森林类型土壤微生物的活性和碳源利用偏好有着显著的不同.
2.5土壤微生物落的主成分分析
将不同样本的多元向量通过主成分分析(principal component analysis,PCA)转换为互不相关的主成分，
可以利用点的位置形象直观地在降维后的主元向量空间中反映出不同微生物落对碳源的代谢特点，可以客观准确地解释微生物对碳源利用的多样性[28].主成分的荷载值越高，意味着碳源对主成分的影响越大.如表3所示，构成第一主成分(PCA1)的碳源有20种，包括4种糖类、6种氨基酸类、3种酯类、3种醇类、3种胺类、5种酸类，其中L-苯基丙氨酸是与PCA1(荷载值为0.996，见表3)最相关的碳源.因此，L-苯基丙氨酸对PCA1产生了主要影响.此外，构成第二主成分(PCA2)的碳源有9种，包括4种糖类、1种氨基酸类、1种酯类和3种酸类，其中D-木糖是与PCA2(荷载值为0.994，见表3)最相关的碳源.因此，L-苯基丙氨酸和D-木糖是对土壤微生物碳代谢活性具有重要影响.主成分分析结果表明，PC1和PC2的方差贡献率分别为38.81%和30.30%(见图4).整体来看，白桦林、蒙古栋林和落叶松林的土壤微生物落功能存在显著差异(见图4).
2.6土壤微生物碳源利用模式的差异及其影响因素
通过典型相关性分析对影响土壤微生物落活性与森林土壤功能多样性的环境因素进行研究.结果(见图5)显示，前两个CCA轴分别解释了方差的35.67%和22.48%，第一CCA轴与土壤pH呈极显著正相关(r=0.9723)，第二个CCA轴与w(SOC) (r=0.7928)、w(TN)(r=0.7998)均呈显著正相关.总体来看,3种森林类型土壤微生物落功能主要受到土壤pH、w(SOC)和w(TN)的影响.韩宝仪全部歌曲 mp3
土壤微生物功能多样性指数与土壤理化性质之间的关系如表4所示.从表4可以看出，对于土壤理化性质,
AWCD值与pH(r=-0.787,P<0.05)呈显著负相关;Shannon-Wiener指数与w(SOC)(r=0.773, P<0.05)呈显著相关，与w(TN)(r= 0.880,P<0.01)呈极显著正相关.
第5期程智超等：黑龙江中央站黑嘴松鸡国家级自然保护区不同森林类型土壤微生物功能多样性分析1181
表331种碳源主要成分的荷载系数手机铃声下载免费下载
Table3Loading factors of principal components of31sole-carbon sources
化学成分Biolog-Eco平板孔号碳源化学式PCA1PCA2 B2D-木糖(D-Xylose)C5H l0O50.1050.994
H1a-D-乳糖(a-D-Lactose)C l2H22O ll-0.2310.973
糖类(Carbohydrate)A20-甲基-D-葡萄糖苷(0-Methyl-D-Glucoside)C7H14O60.9690.249
G2a-D-葡萄糖-1-磷酸(a-D-Glucose-1-Phosphate)C6H l3O l0p0.6110.792 E1a-环式糊精(a-Cyclodextrin)C36H60O30"H200.9960.084 F1肝糖(Glycogen)GH io OJ〃0.1150.993
G1D-纤维二糖(D-Cellobiose)C l2H22O ll0.9940.111 A4L-精氨酸(L-Arginine)C6H14N4O20.990-0.143 B4L-天门冬酰胺(L-Asparagine)C27H l8C l3N3O0.9910.135
氨基酸类C4L-苯基丙酰胺(L-Phenylalanine)C9H11NO20.9960.084 (Amino acids)D4L-丝氨酸(L-Serine)HOCH2CH(NH2)CO2H0.9910.137
E4L-苏氨酸(L-Threonine)C4H9NO30.9950.096
F4甘氨酰-L-谷氨酸(Glycyl-L-Glutamic Acid)C7H l2N2O50.7540.657
B1丙酮酸甲酯(P)yruvic Acid Methyl Ester)C4H6O30.9390.345酯类C1吐温40(Tween40)C22H42O6"(C2H4O)n0.9170.399 (Esters)D1吐温80(Tween80)C24H44O6"(C2H4O)n0.9850.175
A3D-半乳糖酸-丫-内脂(D-galactonic acid^-lactone)C g H io O g0.4800.877
醇类(Alcohols)C2i-赤藓糖醇(i-Erythritol)C4ISO40.9870.159 D2D-甘露醇(D-Mannitol)C6H14O60.9940.111 H2D,L-a-磷酸甘油(D,L-a-Glycerol Phosphate)C3H9O6P0.9040.428
胺类(Amine)G4苯乙胺(Phenylethylamine)C8H h N：C6H5CH2CH2NH20.9870.161 H4腐胺(Putrescine)C4H12N20.9870.160 E2N-乙酰-D-葡萄糖胺(N-Acetyl-D-Glucosamine)C&H|小060.9950.097 B3D-半乳糖醛酸(D-galacturonic acid)C g H io O?0.4430.897 F2D-葡萄糖胺酸(D-glucosaminic acid)C6H|3NO60.5340.845 C32-羟基苯甲酸(2-Hydroxy Benzoic Acid)C7H6O30.9960.084
酸类D34-羟基苯甲酸(4-Hydroxy Benzoic Acid)
女主播直播房C7H6O30.9500.312 (Acids)E3Y-(丫-Hydroxybutyric Acid)C4H8O30.9940.109 F3衣康酸(Itaconic Acid)C5H6O40.1600.987
G3a-丁酮酸(a-Ketobutyric Acid)C4H6O30.9960.084
H3D-苹果酸(D-Malic Acid)C4H6O50.1400.990
2.7讨论
2.7.1不同森林类型土壤理化性质的变化
森林类型的不同会导致凋落物和根系分泌物产生差异，凋落物和根系分泌物会对土壤理化性质产生影响，从而影响土壤微生物的结构和功能.有研究表明，凋落物和根系分泌物对土壤微生物结构组成具有显著影响[29].因此，研究不同森林类型中土壤理化性质和土壤微生物之间的关系，对于了解植被改变后土壤生态系统功能的改变十分重要•该研究地点位于黑龙江黑嘴松鸡国家自然保护区内，其森林系统属于大小兴安岭森林交错区，而且由于人为干扰和破坏，目前该地区森林以次生演替中的阔叶树种和原始兴安落叶松为主，不同类型植被交错分布，是研究森林改变后土壤生态系统功能的良好区域.
该地区土壤pH呈酸性，范围为4.39~6.03.其中，落叶松林的土壤pH最低，为4.39，而白桦林的土壤pH最高，为6.03.这些差异可能与不同凋落物的化学成分差异有关[30].与其他2种森林类型相比，落叶松林凋落物质量低,TN含量低,C/N高，木质素含量高，木质素/氮高.因此，落叶松林凋落物的分解速度和植物养分的释放速度逐渐减慢[30].这可能是造成落叶松林下土壤pH较低的原因.此外，该研究还发现，与针叶林相比，阔叶林(白桦林和蒙古栋林)生态系统中w(SOC)和w(TN)更高(见表1).这与已有研究结果[31]一致，即阔叶林的土壤有机质和氮含量高于针叶林.而且，一些研究也发现针叶林中的土壤
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